湯俊，胡征宇

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，湖北武漢430072）

正常情況下，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)可以精確的調(diào)控自由基的產(chǎn)生和清除，使之處于動(dòng)態(tài)平衡中，但很多因素，如輻射、污染以及機(jī)體健康狀態(tài)等都可以影響或打破這個(gè)平衡，使機(jī)體內(nèi)的自由基過量積累而造成傷害，如引起脂質(zhì)過氧化而改變生物膜結(jié)構(gòu)及功能、損傷DNA、使蛋白質(zhì)變性及酶活力喪失等，這些危害都直接或間接的導(dǎo)致了炎癥、衰老、心血管疾病及腫瘤的發(fā)生[1-2]。

研究證明，一些來源于高等植物或藻類的天然化合物，特別是天然多糖，具有優(yōu)良的抗氧化活性[3-4]，在預(yù)防心腦血管疾病、癌癥以及帕金森氏癥等神經(jīng)退行性疾病方面起著非常重要的作用，因此尋找新的安全、有效、經(jīng)濟(jì)的天然抗氧化劑成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[5-7]。

地木耳，學(xué)名為普通念珠藻（Nostoc commune），隸屬藍(lán)藻門念珠藻屬，是一種分布很廣的食用念珠藻。地木耳富含有多種人體所必需氨基酸、微量元素和維生素，而且蛋白質(zhì)的含量高，具有很高的保健價(jià)值。本文采用體外清除超氧自由基、羥自由基、脂質(zhì)自由基及對(duì)人胚腎細(xì)胞293 的超氧化歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性的影響等模型來評(píng)價(jià)其多糖的抗氧化活性，以期為地木耳的功用開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料與方法

1.1 多糖提取物的制備

地木耳藻體粉碎后用80%乙醇浸泡24 h，索氏提取器提取至浸出液無色。藻體懸于蒸餾水中，95 ℃水提3 h，收集上清液，濃縮后加乙醇得絮狀沉淀，離心收集并用乙醇和丙酮重復(fù)洗滌3 次，冷凍干燥，得多糖提取物。

1.2 清除超氧陰離子自由基

采用氮藍(lán)四唑還原法測(cè)定提取物對(duì)超氧自由基的清除作用。超氧自由基由還原性輔酶I/吩嗪硫酸甲酯體系產(chǎn)生[8]。反應(yīng)體系：Tris-HCl 緩沖液（20 μmol/mL，pH 8.0）中，含有還原性輔酶I，吩嗪硫酸甲酯，氮藍(lán)四唑以及不同濃度的多糖提取物（2 μg/mL～40 μg/mL）。搖勻，室溫反應(yīng)5 min，于560 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A）并根據(jù)下列公式計(jì)算清除率。

清除率= [（A 對(duì)照－A 樣品）/A 對(duì)照]×100%

1.3 清除羥自由基活性測(cè)定

羥自由基由Fe3+/H2O2/脫氧核糖體系產(chǎn)生[9]。磷酸緩沖液（20 μmol/mL，pH 7.4）中，包含EDTA、FeCl3·6H2O、抗壞血酸、H2O2、脫氧核糖及不同濃度（6 μg/mL～30 μg/mL）的多糖溶液，37 ℃水浴1 h，加10%三氯乙酸及1%硫代巴比妥酸，沸水浴15 min，測(cè)定532 nm波長(zhǎng)處吸光值，計(jì)算清除率。在不含EDTA 體系中，EDTA 由等體積的磷酸緩沖液代替[10]。

1.4 抑制蛋黃勻漿脂質(zhì)過氧化活性

采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[11]。以1.15%的氯化鉀稀釋成10%的蛋黃勻漿，現(xiàn)配現(xiàn)用。蛋黃勻漿與FeSO4（100 μmol/L），H2O（250 μmol/L）及不同濃度的提取物混勻，加蒸餾水調(diào)整體積至1 mL，37 ℃水浴1 h。然后加三氯乙酸（20%，pH 3.5）和硫代巴比妥酸（0.67%）各1.5 mL 并繼續(xù)水浴15 min。離心取上清液在532 nm處測(cè)定光吸收值，計(jì)算清除率。

1.5 人胚腎細(xì)胞293 抗氧化酶活力的測(cè)定

1.5.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定

采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）微量酶反應(yīng)比色法測(cè)定細(xì)胞存活率[12]。人胚腎細(xì)胞293（HEK293）以4×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度（0.5 μg/mL～30 μg/mL）的多糖提取物。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。在孵育的最后4 h，加入5 mg/mL 的MTT。孵育結(jié)束后，除去MTT 溶液，加入DMSO 以溶解形成的甲瓚顆粒，在570 nm 處測(cè)定光吸收值。

1.5.2 細(xì)胞SOD，CAT 和GPx 酶的制備及活力測(cè)定

將HEK293 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。24 h 后，吸除培養(yǎng)液，加入含有不同濃度提取物（1、5、25 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、PBS 清洗，離心后用超聲波破碎，14 000 g 離心15 min 收集上清，采用試劑盒測(cè)定SOD，CAT 和GPx 的酶活力。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin 7.0 處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 清除超氧陰離子自由基

在輔酶I 和吩嗪硫酸甲酯體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除實(shí)驗(yàn)中，地木耳多糖提取物表現(xiàn)出顯著的清除超氧自由基的活性，并且隨濃度的升高清除作用增強(qiáng)見圖1。

圖1 地木耳及多糖提取物清除超氧陰離子自由基Fig.1 Superoxide radical scavenging effect of polysaccharide extracts from N.commune

由圖1 可知，在提取物濃度為6 μg/mL 處，清除作用有非常顯著的上升趨勢(shì)，清除率由2 μg/mL 處的3.9%上升到44.1%。隨后，隨著多糖濃度的升高，清除活性呈現(xiàn)緩慢增強(qiáng)的趨勢(shì)，在40 μg/mL 時(shí)，清除作用達(dá)到53.9%。

2.2 清除羥自由基

地木耳多糖提取物清除不同體系產(chǎn)生的羥自由基，見圖2。

圖2 地木耳多糖提取物清除不同體系產(chǎn)生的羥自由基Fig.2 Scavenging effect of polysaccharide extract of N.commune on hydroxyl radical generated in different systems

如圖2 所示，地木耳多糖提取物對(duì)兩個(gè)體系產(chǎn)生的羥自由基均具有清除作用且呈現(xiàn)量效關(guān)系，最高清除率分別為30 μg/mL 濃度處的23.5%和24.2%。但在6 μg/mL～18 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，地木耳多糖提取物對(duì)非特異體系產(chǎn)生的羥自由基清除活性明顯高于特異體系。

2.3 抑制脂質(zhì)過氧化

地木耳多糖提取物抑制脂質(zhì)過氧化，見圖3。

圖3 地木耳多糖提取物抑制脂質(zhì)過氧化Fig.3 Inhibition effect on lipid peroxidation of polysaccharide extracts from N.commune

圖3 顯示，地木耳多糖提取物對(duì)蛋黃勻漿作為介質(zhì)的脂質(zhì)過氧化有較顯著的抑制作用。在10 μg/mL的濃度下，脂質(zhì)過氧化抑制率為3.7%，作用不顯著。但隨提取物濃度的升高，清除率顯著增強(qiáng)，在100 μg/mL的最高測(cè)試濃度下，清除率達(dá)到17.4%。

2.4 HEK293 細(xì)胞存活率的測(cè)定

細(xì)胞和不同濃度的多糖提取物共同孵育24、48、72 h，將對(duì)照組光吸收值設(shè)定為100%，測(cè)定細(xì)胞存活率，見圖4。

圖4 地木耳多糖提取物對(duì)人胚腎細(xì)胞293 存活率的影響Fig.4 Effect of N.commune polysaccharide extract on the viability of HEK 293cells

如圖4 所示，存活率無顯著差異，說明提取物對(duì)HEK293 細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。

2.5 酶活力測(cè)定

酶活力測(cè)定，見表1。

由表1 可以看出，在1 μg/mL 濃度處，多糖提取物對(duì)SOD、CAT、GPx 的酶活力增強(qiáng)作用微弱，但是隨著多糖濃度的升高，提取物對(duì)酶活力表現(xiàn)出顯著的增強(qiáng)作用。 SOD 酶活力在5 μg/mL 濃度處提升最大，為18.9%。CAT 和GPx 的酶活力均在25 μg/mL 濃度處得到最大提高，提高率分別達(dá)到31.9%、39.6%。結(jié)果表明，地木耳多糖提取物對(duì)GPx 和CAT 的酶活力影響要高于對(duì)SOD 酶活力的影響。

表1 地木耳多糖提取物對(duì)HEK293 細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）酶活力的影響Table 1 Effect of N.commune extract on the activities of SOD，CAT and GPx in HEK 293 cells

3 分析與討論

自從提出衰老的自由基學(xué)說以來，大量的研究發(fā)現(xiàn)人類的許多疾病都與機(jī)體的自由基氧化損傷有關(guān)[13]。在尋找抗氧劑的過程中，人們發(fā)現(xiàn)微量元素、維生素、中草藥、食品的有效成分等均具有清除自由基的作用，而抗氧化多糖因其低毒、安全、來源廣等特點(diǎn)備受關(guān)注[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖的抗氧化活性可能是多糖抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗炎癥等其他活性的作用機(jī)理之一[16-17]。

超氧陰離子自由基和羥自由基是最具代表性的活性氧自由基。在機(jī)體的氧化反應(yīng)中，超氧陰離子自由基通常最先形成，其本身活性較弱，但可通過形成其他多種有破壞作用的自由基而使其功能放大。羥自由基是毒性最強(qiáng)的自由基，它幾乎能與所有的功能性生物大分子起反應(yīng)，造成生物體的巨大傷害，例如攻擊膜質(zhì)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化[18-19]。脂質(zhì)過氧化則是由于不飽和脂肪酸鏈的氫被抽掉而引發(fā)的特征性鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷的主要原因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地木耳多糖提取物能有效的清除超氧自由基、羥自由基、抑制蛋黃勻漿過氧化反應(yīng)，還可顯著提高抗氧化酶的活性。

羥自由基的清除活性測(cè)定，一般采用位點(diǎn)特異和非特異兩個(gè)體系。地木耳多糖提取物對(duì)位點(diǎn)特異體系產(chǎn)生的羥自由基的清除活性高于非特異體系，分析其原因，可能是由于位點(diǎn)非特異體系中有EDTA 的存在，對(duì)體系中的二價(jià)鐵離起到螯合作用，使羥自由基的產(chǎn)生受到限制。而在位點(diǎn)特異體系中，EDTA 被磷酸緩沖液代替，自由基的生成和提取物對(duì)金屬離子及對(duì)自由基的清除作用都不會(huì)受到限制，因而清除率要高于非特異體系。

SOD、CAT 和GPx 是生物體抗氧化酶系統(tǒng)中非常重要的三種酶。一般情況下，它們參與并介導(dǎo)自由基的產(chǎn)生與淬滅，維持體內(nèi)自由基的正常代謝水平[20]。SOD 催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2，而H2O2和其它內(nèi)源及外源的過氧化物又可被CAT 和GPx 進(jìn)一步清除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地木耳多糖提取物可顯著提高三種抗氧化酶的活性，有效的降低細(xì)胞所受到的自由基的危害。

黃澤波等對(duì)念珠藻多糖組分及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)，地木耳多糖含有半乳糖、葡萄糖、木糖、海藻糖等組分[21]。這些單糖都是有效的還原劑，其抗氧化作用可能與其組分的還原性質(zhì)有關(guān)。

綜上所述，地木耳多糖提取物抗氧化活性顯著，可以作為天然抗氧化劑的優(yōu)良來源。

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