繆成貴，黃 成，黃 艷，李小楓，李 俊

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032;2.安徽科技學(xué)院藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233000)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、多關(guān)節(jié)性疾病，發(fā)病機(jī)制仍不清楚。世界范圍內(nèi)RA發(fā)病率為0.5%～1.0%，部分地區(qū)高達(dá)5%。RA嚴(yán)重影響了病人的生存質(zhì)量和生命預(yù)期，其并發(fā)癥包括胸膜炎、心包炎、脈管炎等，并可導(dǎo)致死亡，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。RA發(fā)病過(guò)程中首先發(fā)生病變的是關(guān)節(jié)滑膜，表現(xiàn)為滑膜的增生和炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致骨和軟骨的破壞，發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，但極有可能與關(guān)節(jié)獨(dú)特的解剖和生理結(jié)構(gòu)有關(guān)。滑膜細(xì)胞的激活增生、淋巴細(xì)胞的侵入、微血管的生成導(dǎo)致滑膜向軟骨表面侵襲增生形成血管翳，破壞骨和軟骨的結(jié)構(gòu)和功能［2］。多種信號(hào)通路調(diào)控了RA的發(fā)生發(fā)展，其中Wnt通路調(diào)控RA發(fā)生發(fā)展作用的研究起步較晚，但研究證明Wnt通路在RA發(fā)生過(guò)程中起重要調(diào)控作用［3］。在RA發(fā)生過(guò)程中 Wnt1、Wnt5a、Wnt7b明顯高表達(dá)，下調(diào) Wnt1、Wnt5a、Wnt7b能夠抑制FLS活化增殖，預(yù)示W(wǎng)nt通路相關(guān)分子可能是潛在的 RA治療靶點(diǎn)［4－6］。

1 RA發(fā)病機(jī)制

關(guān)節(jié)滑膜襯里層由二到三層巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和FLS伴較密基質(zhì)構(gòu)成，巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞、FLS、樹(shù)突狀細(xì)胞、激活的淋巴細(xì)胞共同調(diào)控抗原的生成，繼而誘發(fā)了異常免疫應(yīng)答［1－2］。一般認(rèn)為抗原誘發(fā)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致了B淋巴細(xì)胞的分化成熟，形成能夠分泌高親和抗體的成熟B淋巴細(xì)胞［7］。雖然沒(méi)有證據(jù)表明何種抗原引發(fā)了RA，但各種內(nèi)源性和外源性抗原在不同程度上引發(fā)了該疾病［7］。能被特異抗體結(jié)合的自身抗原可能來(lái)自于關(guān)節(jié)組織損傷和細(xì)胞凋亡釋放的自體固有而未被免疫系統(tǒng)適應(yīng)的成分。同時(shí)能識(shí)別IgG Fc段的抗體亦是重要的類(lèi)風(fēng)濕抗原。增加的抗原抗體復(fù)合物進(jìn)一步激活了信號(hào)瀑布，加重了炎癥［1－2］。盡管RA的疾病表現(xiàn)不同，但大多數(shù)病人都伴有淋巴細(xì)胞不同程度的侵潤(rùn)［1－2］。淋巴細(xì)胞的侵入通常是無(wú)序混亂的，主要有無(wú)規(guī)分布于巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞、FLS周邊活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞。淋巴細(xì)胞的侵入可能進(jìn)一步增強(qiáng)了FLS的增生和炎癥［7］。在大約20%病人的滑膜組織形成囊性生發(fā)中心，其中包含來(lái)自于血液侵入的淋巴細(xì)胞。發(fā)生改變的滑膜持續(xù)的釋放細(xì)胞因子、趨化因子、金屬蛋白酶、血管生成因子，進(jìn)而造成軟骨的破壞和骨的重吸收［8］。激活的FLS調(diào)控了滑膜慢性炎癥和骨的侵蝕，在RA的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。FLS具有干細(xì)胞的增生特性，可能源于關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致的FLS代償性再生［9］，部分FLS也有可能來(lái)自通過(guò)脈管通道自骨髓或直接通過(guò)血液循環(huán)遷移而來(lái)的間質(zhì)干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞［10］。增生的FLS釋放細(xì)胞因子和趨化因子，例如IL-6、IL-8、IL-15、基質(zhì)細(xì)胞起源因子SDF-1等，這些小分子進(jìn)一步促進(jìn)了淋巴細(xì)胞由血管內(nèi)向滑膜的遷入、活化。FLS能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，例如纖維連接蛋白、細(xì)胞黏附分子，這些分子起到了招募和駐留淋巴細(xì)胞的作用，同時(shí)FLS可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP3、基質(zhì)降解酶(stromelysin 1)，增強(qiáng)了軟骨的降解［1－2］。FLS 增強(qiáng)了針對(duì)關(guān)節(jié)軟骨降解生成抗原的免疫應(yīng)答，促進(jìn)SDF-1和其它內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF、VEGF介導(dǎo)的血管再生。表達(dá)于 FLS和 T細(xì)胞上的 NF-κB配體(RANKL)與表達(dá)于單核細(xì)胞上的共用受體RANK相互作用起始了破骨細(xì)胞的分化和骨的重吸收［11］，調(diào)控了具有破壞軟骨的血管翳的形成，造成不可逆的關(guān)節(jié)損壞。

2 Wnt通路

2.1 Wnt通路組成 Wnt是一種糖蛋白，能夠結(jié)合Fz胞外區(qū)的半胱氨酸富集區(qū)，與Fz特異的結(jié)合啟動(dòng)了胞內(nèi)的一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，上調(diào)了細(xì)胞的增殖。Fz是一種七次跨膜蛋白，類(lèi)似于G蛋白偶聯(lián)型受體。胞外區(qū)的N端具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)，能與Wnt結(jié)合。在輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LDL 5/6)協(xié)同作用下，F(xiàn)rz作用于胞質(zhì)內(nèi)的散亂蛋白(Dvl)，散亂蛋白被募集至細(xì)胞膜附近，能切斷β-catenin的降解途徑，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累。生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)的β-catenin與Dvl、酪蛋白激酶1(CK1)、axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因蛋白(APC)、肝糖合酶激酶3-β(GSK3-β)結(jié)合形成復(fù)合物，CK1對(duì) β-catenin的第45位殘基進(jìn)行絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，此反應(yīng)又催化了GSK-3β對(duì)β-catenin的第41、37和33位殘基磷酸化，被磷酸化標(biāo)記的β-catenin被泛素連接酶β-TrCP蛋白識(shí)別進(jìn)而被泛素化，最后被蛋白酶體介導(dǎo)的泛素化降解，胞質(zhì)中只表達(dá)低水平的β-catenin。Wnt結(jié)合Fz后，Dvl被激活后從βcatenin、Dvl、CK1、axin、APC、GSK3-β 大分子復(fù)合物上解離下來(lái)，導(dǎo)致GSK3-β失活，復(fù)合物分解，胞質(zhì)中β-catenin水平升高并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(TCF/LEF)等結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)細(xì)胞增殖等效應(yīng)。內(nèi)源性的Wnt通路負(fù)調(diào)控蛋白已經(jīng)引起人們的重視，這些負(fù)調(diào)控蛋白可以作為下調(diào)Wnt通路的潛在靶點(diǎn)。Fz蛋白的胞外區(qū)能夠與Wnt對(duì)抗蛋白DKK結(jié)合，一旦結(jié)合發(fā)生即可阻斷Wnt介導(dǎo)的激活信號(hào)［12］。細(xì)胞外分泌蛋白SFRPs含有與Fz胞外區(qū)相似的區(qū)域，可與Wnt蛋白結(jié)合阻斷Wnt與Fz的特異結(jié)合，同樣下調(diào)Wnt介導(dǎo)的細(xì)胞增殖激活信號(hào)。一般認(rèn)為SFRPs是Wnt的負(fù)調(diào)控蛋白，但又報(bào)道表明，在特定情況下，SFRPs也是Wnt蛋白的分子伴侶，保護(hù)Wnt蛋白不被降解［13］。

2.2 Wnt通路分類(lèi) Wnt通路分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路，劃分的依據(jù)是信號(hào)通路的激活是否依靠β-catenin的活化，大多數(shù)關(guān)于Wnt通路的研究著眼于 β-catenin介導(dǎo)的Wnt經(jīng)典通路。在結(jié)腸癌中，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中的β-catenin上調(diào)了myc、cyclin D1等基因，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖癌變［14］。在非洲蟾蜍中，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中的β-catenin上調(diào)了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、纖維連接蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和活化［15］。有證據(jù)表明ERK家族激酶能夠被Wnt經(jīng)典通路激活，參與數(shù)種細(xì)胞分化過(guò)程。Wnt非經(jīng)典通路包括Wnt/Ca2+信號(hào)途徑和細(xì)胞極性通路。Wnt4、Wnt5a、Wnt11能夠激活非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)途徑，此激活過(guò)程通過(guò)特定的G蛋白激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)，后者水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)生成二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。細(xì)胞膜上的DAG在Ca2+和磷脂酰絲氨酸協(xié)助下激活蛋白激酶C(PKC)，PKC作用于細(xì)胞膜受體、膜蛋白等相應(yīng)靶蛋白，使之磷酸化而影響信號(hào)傳導(dǎo)，例如PKC能上調(diào)原癌基因cjun、c-fos表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞增生癌變。IP3是Ca2+通道激活劑，能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存的Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)能開(kāi)放細(xì)胞膜上的Ca2+通道使細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加，激活鈣調(diào)蛋白(CaM)。Ca2+與CaM結(jié)合后形成Ca2+/CaM復(fù)合物激活下游效應(yīng)蛋白-CaM激酶，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞極性通路前半部分與Wnt經(jīng)典通路完全相同，不同點(diǎn)在于Dvl處。Dvl由保守區(qū)域DIX、PDZ和DEP組成，DIX和PDZ參與經(jīng)典Wnt通路，只有DEP參與細(xì)胞極性通路的激活，例如Wnt7a與Fz受體結(jié)合能夠激活細(xì)胞極性通路，其下游激活的靶基因包括Dsh、VanGogh、prickle、Strabismu、diego 和 flamingo 等［16］。

2.3 Wnt蛋白合成 大多數(shù)Wnt蛋白大小40ku，含有350個(gè)左右的氨基酸殘基，具有相似的分子結(jié)構(gòu)。不同物種間有約23～25個(gè)半胱氨酸殘基高度保守［17］。Wnt蛋白N端的疏水性信號(hào)序列有助于Wnt蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未成熟的Wnt蛋白通過(guò)不同途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾成為成熟Wnt蛋白。首先，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未成熟Wnt蛋白可以發(fā)生糖基化修飾。未成熟Wnt蛋白在寡糖基轉(zhuǎn)移酶(oligosaccharyl transferase complex，OST)復(fù)合物的催化下將N連接寡糖鏈連接于Wnt蛋白骨架中合適的氨基酸殘基上，使之糖基化。Wnt蛋白N端糖基化的作用尚未完全闡明，有研究表明小鼠Wnt1潛在糖基化位點(diǎn)的部分或完全變異并未影響其功能［18］。其次，未成熟蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可以發(fā)生棕櫚酰化。棕櫚?；木唧w功能也未完全闡明，可能的功能是疏水的棕櫚?；鶊F(tuán)促進(jìn)Wnt蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜移動(dòng)，促進(jìn)OST復(fù)合物糖基化未成熟Wnt蛋白。同時(shí)棕櫚?；瘜?duì)Wnt蛋白的功能也有重要影響，例如Wnt3a在去除棕櫚酰基后功能也同時(shí)喪失［17］。Porcupine蛋白是膜結(jié)合的 O-?；D(zhuǎn)移酶(membrane-boundO-acyltransferase，MBOAT)家族的一員，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Porcupine蛋白在Wnt蛋白糖基化和棕櫚?；^(guò)程中均有作用。缺乏porcupine導(dǎo)致寡糖鏈不能黏附，過(guò)度表達(dá)porcupine導(dǎo)致Wnt蛋白異位糖基化［17］。Porcupine結(jié)合Wnt蛋白可能影響Wnt蛋白的構(gòu)象，有利于Wnt蛋白的糖基化和棕櫚酰化［19］。

2.4 Wnt蛋白分泌 成熟的Wnt蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，再通過(guò)不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)釋放。成熟功能性Wnt蛋白可以通過(guò)bulk flow途徑分泌，經(jīng)未調(diào)節(jié)分泌小泡離開(kāi)表達(dá)細(xì)胞。有研究表明細(xì)胞中內(nèi)涵體小室、內(nèi)涵體與質(zhì)膜之間的循環(huán)小泡含有Wnt蛋白［20］。這些成熟Wnt蛋白可能來(lái)自于分泌細(xì)胞分泌后再內(nèi)吞或分泌前經(jīng)某種機(jī)制導(dǎo)入到這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Wnt蛋白分選進(jìn)入不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是Wnt蛋白成熟的關(guān)鍵步驟之一，可能會(huì)影響到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的范圍。盡管多數(shù)研究顯示W(wǎng)nt蛋白通過(guò)細(xì)胞外的可控?cái)U(kuò)散方式到達(dá)目標(biāo)區(qū)域，但Wnt蛋白的釋放后遷移是通過(guò)細(xì)胞外的可控?cái)U(kuò)散還是直接的跨細(xì)胞方式到達(dá)目標(biāo)區(qū)域一直存在爭(zhēng)議［21－22］。Pankovd［23］等研究發(fā)現(xiàn)脂蛋白顆粒對(duì)Wnt蛋白的遠(yuǎn)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的，但對(duì)近距離的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)沒(méi)有明顯影響，提示脂蛋白對(duì)Wnt的分泌有一定的作用。Wntless(Wls)是一個(gè)7次跨膜，能與Wnt相互作用的高度保守蛋白，Wnt蛋白表達(dá)Wls下調(diào)時(shí)，Wnt蛋白滯留在其分泌細(xì)胞內(nèi)，提示W(wǎng)ls對(duì)Wnt蛋白的分泌至關(guān)重要［24］。Retromer是一高度保守的多蛋白復(fù)合物，其核心包含Vps35、Vps29及Vps26亞基。缺失核心蛋白Vps35后線蟲(chóng)內(nèi)的EGL-20/Wnt信號(hào)傳導(dǎo)喪失［25］。同樣在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和非洲爪蟾中敲除Vps35能夠阻斷Wnt目標(biāo)基因的表達(dá)。提示Retromer蛋白對(duì)Wnt蛋白的分泌發(fā)揮了重要作用［26］。

2.5 Wnt調(diào)控骨的形成和骨的重吸收 研究證明Wnt信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控造骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖分化增加了骨的形成。造骨細(xì)胞祖細(xì)胞敲除β-catenin后抑制了表達(dá)骨鈣素的造骨細(xì)胞的分化。另外Wnt信號(hào)可以促進(jìn)造骨細(xì)胞osteoprotegerinin的上調(diào)表達(dá)，因?yàn)閛steoprotegerinin可以抑制破骨細(xì)胞的分化，Wnt信號(hào)可以部分通過(guò)抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨的再吸收增加骨的密度［27］。Dickkopf家族蛋白、Wise蛋白和sclerostin蛋白等在調(diào)控骨的形成和骨的再吸收過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，調(diào)控了Wnt/β-catenin通路激活。這些蛋白能夠與Wnt、Fz、LRP5和LRP6結(jié)合激活或者抑制通路活性［28］。DKK1是Wnt/β-catenin通路的可溶性抑制蛋白，通過(guò)結(jié)合到Wnt共受體LRP5抑制Wnt通路活性。增加的DKK1水平增加了骨的再吸收，減少DKK1水平增加了骨的形成。LRP5突變導(dǎo)致高骨密度為特征的綜合征，雌激素和糖皮質(zhì)激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥很有可能與造骨細(xì)胞DKK1的激活有關(guān)［29］。在C57BL/6J小鼠中轉(zhuǎn)染arthritogenic K/BxN制備鼠關(guān)節(jié)炎模型，炎癥控制后骨的重吸收停止，造骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成，修復(fù)侵蝕骨。同時(shí)炎癥控制后伴隨明顯的Wnt通路改變，即在炎癥控制階段Wnt負(fù)調(diào)控基因SFRP1、SFRP2表達(dá)下調(diào)，Wnt10b表達(dá)上調(diào)了，說(shuō)明炎癥調(diào)控了Wnt通路，同時(shí)說(shuō)明Wnt通路對(duì)造骨細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨修復(fù)是至關(guān)重要的［30］。

3 Wnt調(diào)控RA機(jī)制

Wnt通路調(diào)控細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞的癌變、腫瘤的侵襲生長(zhǎng)等，與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，在在膀胱癌、胃癌、宮頸腺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌等各種癌組織細(xì)胞中均高表達(dá)Wnt蛋白和Wnt通路相關(guān)分子。Wnt通路調(diào)控RA發(fā)病機(jī)制研究起步較晚，但近幾年此方面研究取得重要進(jìn)展，并證明Wnt通路在調(diào)控RA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。與正常成人滑膜組織相比，Wnt和 Fz同源分子，例如 Wnt1、Wnt5a、Wnt7b和Fz5，在RA病人滑膜組織中明顯高表達(dá)，并且Wnt1、Wnt5a高于炎癥較輕為特征的骨關(guān)節(jié)炎，提示W(wǎng)nt1，Wnt5a和Fz5的高表達(dá)可能與炎癥程度有關(guān)［4-6］。在RA病人關(guān)節(jié)FLS中同樣檢測(cè)到了Wnt1，Wnt5a和Fz5的高表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Wnt1，Wnt5a和Fz5與RA密切相關(guān)。但實(shí)驗(yàn)證明同樣的Wnt/Fz表達(dá)持續(xù)時(shí)間與增加的細(xì)胞因子并沒(méi)有直接的量化關(guān)系，說(shuō)明炎癥對(duì)Wnt/Fz的影響可能在Wnt通路的上游，即 Wnt通路負(fù)調(diào)控基因 SFRPs、DDKs等［4－5］。SFRPs作為Wnt的負(fù)調(diào)控蛋白分子在 RA 滑膜組織和FLS中都有表達(dá)，即RA特異的疾病內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)了SFRPs的差異表達(dá)。SFRPs與炎癥因子及SFRPs與RA發(fā)病機(jī)制的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.1 Wnt1調(diào)控RA發(fā)生過(guò)程 TCF報(bào)告基因分析，Wnt 1誘導(dǎo)FLS的Wnt通路激活，上調(diào)前MMP3和纖維連接蛋白的表達(dá)。FLS中Wnt 1介導(dǎo)的信號(hào)刺激了前MMP3的合成，在非RA FLS中轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt 1表達(dá)載體上調(diào)了前MMP3，采用抗Wnt 1抗體或重組SFRP1抑制了其合成。RAFLS轉(zhuǎn)染dn LEF1或dn TCF4后前MMP3的水平?jīng)]有明顯變化，說(shuō)明前MMP3的合成不是通過(guò)經(jīng)典的Wnt/LEF/TCF途徑。因?yàn)榍癕MP3基因啟動(dòng)子有AP1結(jié)合位點(diǎn)，很有可能Wnt 1介導(dǎo)的前MMP3合成是通過(guò)JNK介導(dǎo)AP1轉(zhuǎn)錄因子家族［4－5］。轉(zhuǎn)染TCF4和LEF1變異載體的FLS能夠抑制纖維連接蛋白的合成，抗Wnt 1抗體和SFRP1能夠起到同樣的作用，說(shuō)明Wnt1在FLS中通過(guò)LEF/TCF途徑調(diào)控了纖維連接蛋白的表達(dá)。纖維連接蛋白是一個(gè)多功能蛋白，不僅能起到存活細(xì)胞的作用，還能促進(jìn)整聯(lián)蛋白(integrin)介導(dǎo)的細(xì)胞黏附作用。纖維連接蛋白是強(qiáng)有力的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)物，能夠促進(jìn)FLS的存活，能夠促進(jìn)RA滑膜中間質(zhì)干細(xì)胞和白細(xì)胞的合并、保留，甚至在缺少前炎癥因子的情況下促進(jìn)增生。FLS中Wnt 1介導(dǎo)的信號(hào)增加了前MMP3分泌增加了成熟MMP3的合成，加重了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。Wnt1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3(WISP3)在RA滑膜中表達(dá)比骨關(guān)節(jié)炎病人或者沒(méi)有風(fēng)濕病的對(duì)照病人高，WISP3在體外被前炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)，其多態(tài)性與青少年多關(guān)節(jié)先天性關(guān)節(jié)炎的易感性相關(guān)［4］。

3.2 Wnt5a調(diào)控RA發(fā)生過(guò)程 Wnt5a調(diào)控了RA的發(fā)生過(guò)程。Wnt5a和Fz5的特異結(jié)合上調(diào)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF，促進(jìn)了滑膜組織新生血管的生成，促進(jìn)滑膜的增殖。Wnt5a和Fz5的特異結(jié)合調(diào)控了炎癥因子的釋放，促進(jìn)了白細(xì)胞自滑膜微血管向滑膜組織的遷入和活化，例如趨化因子SDF-1在Wnt5a激活Wnt通路后表達(dá)上調(diào)?？笷z5血清處理RA FLS導(dǎo)致了RANKL的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明Wnt5a同樣參與了軟骨的侵蝕和骨的吸收。轉(zhuǎn)染正常FLS Wnt5a表達(dá)載體上調(diào)了細(xì)胞因子、趨化因子(IL-6，IL-8和IL-15等)的表達(dá)，轉(zhuǎn)染RA FLS反義Wnt5a或負(fù)調(diào)控Wnt5a載體下調(diào)了上述分子的表達(dá)。Dn-Wnt5a在細(xì)胞表面與Wnt5a受體結(jié)合阻斷了Wnt5a與其對(duì)應(yīng)Fz受體結(jié)合，下調(diào)了Wnt5a激活Wnt通路的作用，抗Fz5血清處理細(xì)胞后細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)同樣下調(diào)了?？笷z5血清與Fz5結(jié)合后特異封閉了Wnt5a與Fz5的親和，證明Wnt與Fz的結(jié)合是有選擇性的、特異的，預(yù)示不同Wnt與Fz的結(jié)合可能產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)。Wnt受體Fz5在Wnt5a激活Wnt信號(hào)通路的過(guò)程中起到了協(xié)同作用，Wnt5a通過(guò)自分泌或旁分泌的形式或兩種形式兼有的方式結(jié)合在Fz5上，但不排除Wnt5a與Fz5相互獨(dú)立的合成最后以匯合的方式結(jié)合在滑膜細(xì)胞表面［4－5］。

3.3 Wnt7b調(diào)控RA發(fā)生過(guò)程 Nakamura等［6］采用原位雜交和免疫組化方法分析發(fā)現(xiàn)在RA關(guān)節(jié)軟骨、骨和滑膜中均高表達(dá)Wnt7b，當(dāng)向RA滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt7b后前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)上調(diào)了，這些因子在RA的發(fā)病機(jī)制中占重要作用，說(shuō)明Wnt7B調(diào)控了RA的發(fā)生過(guò)程。

4 Wnt通路是潛在的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)

Wnt通路在器官發(fā)育、軟骨形成、骨的吸收和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要調(diào)控作用，目前研究證實(shí)Wnt通路調(diào)控了RA的發(fā)生過(guò)程，在RA發(fā)生過(guò)程中Wnt1、Wnt5a、Wnt7b明顯高表達(dá)，上調(diào)了MMP3、纖維連接蛋白、細(xì)胞因子等表達(dá)，促進(jìn)FLS活化增殖、滑膜增生、血管翳、新生血管的生成等，在RA發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題組采用福氏完全佐劑制備SD大鼠RA模型并鑒定，造模后股動(dòng)脈放血處死大鼠，分離膝關(guān)節(jié)滑膜組織，組織塊法貼壁原代培養(yǎng)FLS并鑒定，RT-PCR、Western印記法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè) SFRP1、MeCP2在對(duì)照大鼠和模型大鼠組織、FLS中的表達(dá)差異，RT-PCR、Western印記法檢測(cè)甲基化抑制劑DAC(5-氮雜2-脫氧胞苷，5-AzadC)、MeCP2 siRNA對(duì)RA模型大鼠FLS SFRP1表達(dá)上調(diào)的作用。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照大鼠相比，RA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織SFRP1表達(dá)明顯下調(diào)，β-catenin表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明在RA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中，Wnt通路是激活的。同時(shí)在滑膜組織中MeCP2表達(dá)明顯增高，預(yù)示在大鼠膝關(guān)節(jié)組織病變過(guò)程中發(fā)生了SFRP1基因的甲基化。在RA模型大鼠FLS同樣存在SFRP1表達(dá)下調(diào)，Wnt經(jīng)典通路關(guān)鍵基因β-catenin表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，對(duì)FLS使用甲基化抑制劑DAC后，SFRP1表達(dá)不同程度上調(diào)，β-catenin表達(dá)不同程度下調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明在病變過(guò)程中發(fā)生了SFRP1基因甲基化，并且病變過(guò)程激活了Wnt經(jīng)典通路。同時(shí)伴隨SFRP1表達(dá)的恢復(fù)，促凋亡基因Bax、Caspase-3表達(dá)明顯升高，說(shuō)明甲基化修飾導(dǎo)致SFRP1表達(dá)恢復(fù)，促進(jìn)過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞凋亡。通過(guò)調(diào)控Wnt通路相關(guān)分子表達(dá)能夠調(diào)控Wnt通路活性和RA的發(fā)生發(fā)展，預(yù)示W(wǎng)nt通路相關(guān)分子能夠作為RA潛在的治療靶點(diǎn)，此方向的進(jìn)一步研究有利于RA的臨床診斷和治療。

［1］Keen H I，Emery P.How should we manage early rheumatoid arthritis?From imaging to intervention［J］.Curr Opin Rheumatol，2005，17(3):280－5.

［2］Tugnet N，Cooper S，Douglas K.Methotrexate therapy，rheumatoid arthritis，and life-threatening liver complications:should we be monitoring more closely［J］?Scand J Rheumatol.2012，41(2):163－4.

［3］Fdes F，da Mota L M，Lima R A，et al.The Wnt signaling pathway and rheumatoid arthritis［J］.Autoimmun Rev，2010，9(4)207－10.

［4］Sen M，Reifert J，Lauterbach K，et al.Regulation of fibronectin and metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoid arthritis synoviocytes［J］.Arthritis Rheum，2002，46(11):2867－77.

［5］Sen M，Chamorro M，Reifert J，et al.Blockade of Wnt-5A/frizzled 5 signaling inhibits rheumatoid synoviocyte activation［J］.Arthritis Rheum，2001，44(4):772－81.

［6］Nakamura Y，Nawa ta M，Wakitani S.Expression profiles and functional analyses of Wnt-related genes in human joint disorders［J］.Am J Pathol，2005，167(1):1－3

［7］Wilson C L，Hine D W，Pradipta A，et al.Presentation of the candidate rheumatoid arthritis autoantigen aggrecan by antigen-specific B cells induces enhanced CD4(+)T helper type 1 subset differentiation［J］.Immunology，2012，135(4):344－54.

［8］Roll P，Muhammad K，Schumann M，et al.RF positivity has substantial influence on the peripheral memory B-cell compartment and its modulation by TNF inhibition［J］.Scand J Rheumatol.2012 Mar 9.［Epub ahead of print］

［9］Yi T，Song S U.Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells and their therapeutic applications［J］.Arch Pharm Res，2012，35(2):213－21.

［10］Mutafchieva M，Williams R O，F(xiàn)una K，et al.Inflammation is preceded by tumor necrosis factor dependent infiltration of mesenchymal cells in experimental arthritis［J］.Arthritis Rheum，2002，46(2):507－13.

［11］Takayanagi H，Ilzuka H，Juji T，et al.Involvement of receptor activator of nuclear factor kappaB ligand/osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis from synoviocytes in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2000，43(2):259－69.

［12］Veeck J，Dahl E.Dickkopf-1 inhibits the invasive activity of melanoma cells［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1825(1):18－28.

［13］Uren A，Reichsman F，Anest V，et al.Secreted frizzled related protein-1 binds directly to Wingless and is a biphasic modulator of Wnt signaling［J］.J Biol Chem，2000，275(6):4374－82.

［14］Cai C，Zhu X.The Wnt/β-catenin pathway regulates self-renewal of cancer stem-like cells in human gastric cancer［J］.Mol Med Report，2012，5(5):1191－6.

［15］Gradl D，Kuhl M，Weldich D.The Wnt/Wingless signal transducer β-catenin controls fibronectin expression［J］.Mol Cell Biol，1999，19(8):5576－87.

［16］Fan X，Krieg S，Hwang J Y，et al.Dynamic regulation of wnt7a expression in the primate endometrium:implications for postmenstrual regeneration and secretory transformation［J］.Endocrinology，2012，153(3):1063－9.

［17］Tanaka K，Kitagawa Y，Kadowaki T.Drosophila segment polarity gene product porcupine stimulates the posttranslational N-glycosylation of wingless in the endoplasmic reticulum［J］.J Biol Chem，2002，277(15):12816－23.

［18］Mason J O，Kitajewski J，Varmus H E.Mutational analysis of mouse Wnt1 identifies two temperature-sensitive alleles and attributes of Wnt1 protein essential for transformation ofa mammary cell line［J］.Mol Biol Cell，1992，3(5):521－33.

［19］Zhai L，Chaturvedi D，Cumberledge S.Drosophila wnt1 undergoes a hydrophobic modification and is targeted to lipid rafts，a process that requires porcupine［J］.J Biol Chem，2004，279，(32):33220－7.

［20］Pfeifer S，Ricardo S，Marmeville J B，et al.Producing cells retain and recycle Wingless in Drosophila embryos［J］.Curr Biol，2002，12(11):957－62.

［21］Vincent J P，Dubois L.Morphogen transport along epithelia，an integrated trafficking problem［J］.Dev Cell，2002，3(5):615－23.

［22］Han C，Yan D，Belenkaya T Y，et al.Drosophila glypicans Dally and Dally-like shape the extracellular W ingless morphogen gradient in the wing disc［J］.Development，2005，132(4):667－79.

［23］Panakova D，Sprong H，Marois E，et al.Lipoprotein particles are required for Hedgehog and Wingless signalling ［J］.Nature，2005，435(7038):58－65.

［24］Bartscherer Pelte N，Ingelfinger D，et al.Secretion of Wnt ligands requires Evi，a conserved transmembrane protein［J］.Cell，2006，125(3):523－33.

［25］Prasad B C，Clark S G.Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C.elegans［J］.Development，2006，133(9):1757－66.

［26］Coudreuse D Y，Roel G，Betist M C，et al.Wnt gradient formation requires retromer function in Wnt-producing cells［J］.Science，2006，312(5775):921－4.

［27］Zuo C，Huang Y，Bajis R，et al.Osteoblastogenesis regulation signals in bone remodeling［J］.Osteoporos Int，2012 Jan 31［Epub ahead of print］

［28］Choi H Y，Dieckmann M，Herz J，et al.Lrp4，a novel receptor for Dickkopf 1 and sclerostin，is expressed by osteoblasts and regulates bone growth and turnoverin vivo［J］.PLoS One，2009，4:(11):e7930.

［29］Polzer K，Zwerina J，Schett G，Diarra D.In flammation and destruction of the joints-The Wnt pathway［J］.Joint Bone Spine，2008，75(2):105－7.

［30］Matzelle M M，Gallant M A，Condon K W，et al.Resolution of inflammation induces osteoblast function and regulates the Wnt signaling pathway［J］.Arthritis Rheum，2011，2(10):10－21.