徐澤凌，陳復(fù)旦，毛碧增

(浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310058)

菌根是土壤中菌根真菌與高等植物的根系形成的一種共生體［1］，大部分陸生植物都與菌根真菌有著共生關(guān)系，真菌有利于生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分的循環(huán)，能夠幫助植物從土壤中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，協(xié)助植物抵御不良環(huán)境的脅迫［2］。同時(shí)真菌可以利用植物光合作用的產(chǎn)物［3］，如叢枝菌根 (AM)真菌能夠和甘蔗等80%的維管開(kāi)花植物相互作用，加快植物生長(zhǎng)，提高對(duì)病害等的抗性［4-6］。然而至今還未獲得AM真菌純培養(yǎng)，這在很大程度上限制了AM真菌分類學(xué)和生理學(xué)的發(fā)展［7］。

印度梨形孢 (Piriformospora indica)是一種類似于AM真菌的內(nèi)生真菌，不同的是，印度梨形孢能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)［8］，且定殖范圍比AM真菌更為廣泛，無(wú)論在單子葉還是雙子葉植物，甚至是苔蘚植物上都能夠定殖［3］。印度梨形孢的生物學(xué)功能已經(jīng)明確，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆等方面都有顯著作用。目前，國(guó)內(nèi)外已有很多研究對(duì)印度梨形孢的作用機(jī)制進(jìn)行探索。本文針對(duì)印度梨形孢與植物的互作機(jī)制及轉(zhuǎn)化體系的研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，以期為印度梨形孢在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 印度梨形孢植物互作機(jī)制

印度梨形孢作為一種定殖范圍廣的有益真菌，在寄主植物根部定殖后，能引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢的定殖主要會(huì)引起相關(guān)基因表達(dá)的改變、激素變化以及一些信號(hào)通路的改變等。

1.1 相關(guān)基因表達(dá)

Schuck等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HSPRO(ORTHOLOG OF SUGAR BEET Hs1pro-1)基因在印度梨形孢和煙草的互作中起著重要作用，該基因表達(dá)的產(chǎn)物可促進(jìn)早期幼苗的生長(zhǎng)，平均比一般野生型植株增加30%的生物合成量。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，野生型煙草植株中檢測(cè)不到HSPRO的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而定殖了印度梨形孢的植株中，該基因有著明顯的表達(dá)。在擬南芥中，HSPRO1和HSPRO2會(huì)與SNF1依賴型的蛋白激酶 SnRK1中的 AKINβγ亞基相互作用，通過(guò)SnRK1控制其他基因的表達(dá)和調(diào)控相關(guān)酶的活力來(lái)調(diào)節(jié)代謝。同時(shí)，還有其他基因也被報(bào)道在印度梨形孢的定殖過(guò)程中其表達(dá)量會(huì)發(fā)生變化。例如，當(dāng)印度梨形孢定殖于大麥根部的過(guò)程中，TLP基因被誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)生TLPs，TLPs能夠在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和囊泡運(yùn)輸中起作用，利于印度梨形孢的定殖［10］。

1.2 激素

研究報(bào)道，當(dāng)piTam1基因被沉默之后，導(dǎo)致生長(zhǎng)素的表達(dá)量有所減少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大麥根部印度梨形孢的定殖量也會(huì)隨之減少，說(shuō)明生長(zhǎng)素可能是印度梨形孢定殖過(guò)程中的一個(gè)促進(jìn)因子［11］。另外，乙烯在印度梨形孢的定殖過(guò)程中是必不可少的。印度梨形孢的定殖可分為兩個(gè)階段，首先是活體細(xì)胞階段，之后伴隨的是細(xì)胞致死階段［11］。Khatabi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在第2個(gè)階段，乙烯能夠增強(qiáng)印度梨形孢在擬南芥根部的定殖，而損壞的乙烯信號(hào)通路會(huì)減少印度梨形孢的定殖。

1.3 信號(hào)傳導(dǎo)

Qiang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在印度梨形孢定殖的細(xì)胞致死階段，印度梨形孢首先抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)的傳導(dǎo)，最后導(dǎo)致一種半胱天冬氨酶依賴型，以液泡為媒介的細(xì)胞死亡。不過(guò)，印度梨形孢只定殖于成熟根部的部分區(qū)域，并不進(jìn)入根部的維管系統(tǒng)，因此并不會(huì)對(duì)根部的生長(zhǎng)和功能造成影響。

除上述基因、激素和信號(hào)傳導(dǎo)在印度梨形孢定殖過(guò)程中的作用之外，還有一些蛋白也起到了關(guān)鍵性的作用。比如，pii-2基因能編碼一種富含亮氨酸的蛋白At5g16590，能夠促進(jìn)印度梨形孢和植物之間的識(shí)別，突變體則無(wú)法識(shí)別印度梨形孢［3］。

2 印度梨形孢遺傳轉(zhuǎn)化

印度梨形孢是一種多核絲狀真菌，通過(guò)DAPI染色發(fā)現(xiàn)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有2～10個(gè)細(xì)胞核不等［14］，印度梨形孢的遺傳相當(dāng)不穩(wěn)定，大大增加了其轉(zhuǎn)化難度。目前已有印度梨形孢轉(zhuǎn)化的相關(guān)報(bào)道。

Zuccaro等［14］利用 PEG法成功將線性載體pvv26轉(zhuǎn)入印度梨形孢中，2周后獲得轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為2%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒載體pBShhn-pTEF轉(zhuǎn)化效率較低，約為1.5%。然而，在原生質(zhì)體的制備方面，Zuccaro等［14］報(bào)道，利用木霉屬溶壁酶未能獲得印度梨形孢的原生質(zhì)體，而課題組分別利用裂解酶、glucanex、溶壁酶和纖維素酶制備原生質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有經(jīng)溶壁酶處理后，才能獲得符合轉(zhuǎn)化要求、濃度為107個(gè)·mL-1的原生質(zhì)體懸浮液，在這點(diǎn)上和Zuccaro等稍有不符。

Kumar等［15］利用更簡(jiǎn)便的電穿孔法也成功獲得了轉(zhuǎn)化菌株。電穿孔法是利用一個(gè)高壓的電脈沖在細(xì)胞膜表面制造出一定量的親水或疏水的微小通道，讓 DNA通過(guò)擴(kuò)散轉(zhuǎn)入細(xì)胞膜內(nèi)［16］。在12 500 V/cm的條件下，把含有RNAi結(jié)構(gòu)的PiPT基因的質(zhì)粒成功導(dǎo)入印度梨形孢中，這也是首次報(bào)道RNAi在印度梨形孢中的應(yīng)用。

3 印度梨形孢在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

印度梨形孢在植物生長(zhǎng)中起重要作用，其一系列生物學(xué)功能已被證實(shí)，如能加快植物生長(zhǎng)、促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性等。印度梨形孢在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中有著廣闊的前景。

3.1 加快植物生長(zhǎng)

印度梨形孢是一種植物內(nèi)生型真菌，在植物體內(nèi)產(chǎn)生的最明顯的生理效應(yīng)就是促進(jìn)植物生長(zhǎng)，這一點(diǎn)已在多種植物中被證實(shí)。Fakhro等［17］研究發(fā)現(xiàn)，將印度梨形孢定殖于番茄的根部時(shí)，印度梨形孢有利于改善番茄的生長(zhǎng)，使其葉的生物量增加20%;此外，在水培過(guò)程中研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢能使番茄果實(shí)鮮重增加100%，干重增加20%。

Sun等［18］以中國(guó)卷心菜為試驗(yàn)材料研究發(fā)現(xiàn)，與印度梨形孢共培養(yǎng)15 d的卷心菜幼苗長(zhǎng)勢(shì)明顯好于未經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的對(duì)照組，根部鮮重增加38±5%，葉部鮮重增加46±6%。同時(shí)，主根和側(cè)根的生長(zhǎng)情況也有較大幅度的提升，葉片鮮重、根部鮮重、氣孔數(shù)量等也有明顯變化。在研究印度梨形孢和玉米的互作時(shí)，Kumar等［19］發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)45 d后，定殖有印度梨形孢的玉米植株干重相比于對(duì)照組可提高1.8倍。

印度梨形孢在大麥、小麥、擬南芥、煙草、玉米等植物上的促生作用也已得到驗(yàn)證。印度梨形孢對(duì)植物的促生能力一般在50%左右，但在很大程度上，由于試驗(yàn)條件和環(huán)境差異的影響，促生能力存在較大的不同［20］。

3.2 促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收

磷是植物生長(zhǎng)過(guò)程中很重要的一種元素，但土壤中的磷很少以可溶性狀態(tài)存在，因此很難被植物利用。植物吸收磷的主要方式有兩種，一種是根部直接吸收，另一種就是依賴共生真菌的協(xié)助［21］。王鳳讓等［22］在研究印度梨形孢及其近似種Sebacina vermifera在番茄上的定殖，以及在不同磷水平下對(duì)番茄生長(zhǎng)發(fā)育的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在低磷條件下，接種印度梨形孢或S．vermifera的植株體內(nèi)磷含量高于未接種的對(duì)照組，根系酸性磷酸酶活性顯著低于未接種植株。說(shuō)明印度梨形孢和S．vermifera能夠促進(jìn)番茄對(duì)磷的吸收，增加植株內(nèi)磷的含量，提高植株對(duì)低磷逆境的抵抗能力。

除了磷元素，Sarma等［23］在研究印度梨形孢對(duì)西紅柿生長(zhǎng)的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在印度梨形孢和熒光假單胞菌R81的作用下，西紅柿植株在氮、磷、鉀的吸收上分別能提高178%，102%和126%。

植物生物量的增加很大程度上依賴于植物對(duì)外界養(yǎng)分的吸收，印度梨形孢能夠參與調(diào)節(jié)植物對(duì)土壤中磷和氮的吸收。試驗(yàn)表明，在擬南芥和番茄中，印度梨形孢能刺激NADH依賴的硝酸鹽還原酶的活性，激活相關(guān)基因的表達(dá)［24］。因此，在作物的栽培中，可通過(guò)印度梨形孢和植物根部的互作來(lái)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。但是，在印度梨形孢的定殖能增強(qiáng)硝酸還原酶的表達(dá)，同時(shí)也能促進(jìn)對(duì)氮的吸收的觀點(diǎn)上，F(xiàn)ranken［20］認(rèn)為，這里有一個(gè)問(wèn)題還不清楚，是因?yàn)橛《壤嫘捂叨ㄖ秤谥参锔看龠M(jìn)植物生長(zhǎng)，加強(qiáng)了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還是因?yàn)橥ㄟ^(guò)加強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)?因此這方面具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3.3 誘導(dǎo)植物抗逆

Sun等［18］研究表明，與印度梨形孢共培養(yǎng)的卷心菜在抗干旱方面強(qiáng)于非共培養(yǎng)的對(duì)照組，將共培養(yǎng)的試驗(yàn)組和空白對(duì)照組在相同的干旱環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，4周后用PEG溶液處理，并于4 d后觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在PEG處理后受到嚴(yán)重的干旱脅迫影響，而試驗(yàn)組未表現(xiàn)出明顯脅迫跡象。另外，陳佑源等［25］利用油菜研究發(fā)現(xiàn)，定殖印度梨形孢的油菜，其抗旱性能有顯著的提高。分析表明，印度梨形孢提高油菜對(duì)干旱脅迫的抗性可能與MDA含量、質(zhì)膜透性、Pro含量、抗氧化酶活性和干旱相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

Baltruschat等［26］以代謝活力、脂肪酸化合物、脂類過(guò)氧化物、抗壞血酸還原酶等為生理指標(biāo)，對(duì)大麥中印度梨形孢介導(dǎo)的抗鹽生化機(jī)制所做研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢定殖的植株具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)弱化了鹽敏感的大麥品種葉片中的NaCl誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化作用、代謝能量外溢和葉片中的脂肪酸稀釋等過(guò)程。

另外，印度梨形孢在抗病方面也有相關(guān)報(bào)道。Molitor等［27］發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢定殖的大麥能對(duì)白粉病菌的感染產(chǎn)生抗性。在冬小麥的溫室培養(yǎng)試驗(yàn)中，Serfling等［24］研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢定殖的冬小麥能夠顯著降低鐮刀菌、小麥基腐病菌、白粉病菌的侵染，但在外界低溫環(huán)境下，印度梨形孢對(duì)葉部病菌侵染抑制效果不是很理想，和未接種印度梨形孢的對(duì)照組幾乎無(wú)區(qū)別。

3.4 其他應(yīng)用

除以上功能外，印度梨形孢還有其他一些作用。例如，在植物組培過(guò)程中，可利用印度梨形孢來(lái)煉苗。據(jù)Sahay等［28］報(bào)道，與印度梨形孢共培養(yǎng)的煙草組培苗在移栽至大田中時(shí)，存活率可達(dá)88%～94%，而未經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的僅有62%。另外在與藥用植物毛喉鞘蕊花的相互作用中，印度梨形孢不但能加快其生長(zhǎng)，增加其產(chǎn)量，甚至還能使其次生代謝物發(fā)生變化［29］。

4 存在問(wèn)題及展望

印度梨形孢定殖廣泛且功能多樣，具有促生、增產(chǎn)、抗逆等多種功能，相比于其他菌根真菌有著許多明顯的優(yōu)勢(shì)?；诖?，印度梨形孢越來(lái)越受到研究關(guān)注，但由于缺乏和寄主植物互作分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，其應(yīng)用受到限制［3］。同時(shí)，由于印度梨形孢遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建存在一定的難度，影響對(duì)印度梨形孢的進(jìn)一步深入研究。另外，關(guān)于利用印度梨形孢來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)其抗逆性是否會(huì)引起植物本身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的改變的問(wèn)題目前也尚未清晰。因此，這些方面都還需要進(jìn)一步研究確定。此外，印度梨形孢并沒(méi)有能夠真正應(yīng)用于大田中，只是停留在實(shí)驗(yàn)室摸索嘗試階段［30］，其利用價(jià)值有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

隨著對(duì)印度梨形孢研究的不斷深入，在闡明其作用機(jī)制的同時(shí)，可將其進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，用于大田作物的栽培中，能有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高干旱、高鹽地區(qū)作物的忍耐性，增強(qiáng)作物對(duì)病害等的抗性，提高作物產(chǎn)量;或?qū)⑵溲兄瞥缮锞驶蛏锘|(zhì)，可用于貧瘠土壤的改良，能有效地減少化學(xué)肥料的使用，減輕由于化學(xué)肥料的使用而帶來(lái)的環(huán)境污染［8］。隨著研究的進(jìn)一步深入，印度梨形孢的作用將會(huì)越來(lái)越顯著，在可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位也將會(huì)越來(lái)越突出。

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