向 勤， 胡國(guó)柱

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2.江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，江西南昌 330006）

中藥多糖抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性凋亡研究進(jìn)展

向 勤1， 胡國(guó)柱2

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2.江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，江西南昌 330006）

神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性損傷是誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病發(fā)病的因素之一。多糖是中藥有效成分之一，具有抗氧化和抗凋亡等生物活性。本文就缺血/缺氧與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系及中藥多糖抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性凋亡機(jī)制的研究現(xiàn)狀做一綜述。

中藥多糖；缺血；缺氧；神經(jīng)細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡 （apoptosois）是細(xì)胞由基因控制的自主有序的細(xì)胞死亡，而腦組織缺血/缺氧易導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［1］。中醫(yī)理論認(rèn)為細(xì)胞作為構(gòu)成生命體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位包含兩方面的屬性，即細(xì)胞增殖屬陽，細(xì)胞凋亡屬陰，增殖與凋亡的平衡是陰陽在細(xì)胞水平反應(yīng)。一旦增殖與凋亡平衡紊亂則出現(xiàn)陰陽的偏盛偏衰的病證。機(jī)體細(xì)胞異常增殖為陽盛，而凋亡減退為陰微；細(xì)胞增殖減退為陽微，而凋亡過盛為陰盛，這是中醫(yī)對(duì)腫瘤形成及自身免疫性疾病發(fā)生的病理生理學(xué)認(rèn)識(shí)，這些變化與多種免疫缺陷病和退行性病變有關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中藥現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)用于抗癌，如小柴胡湯其黃芩苷元可引起典型細(xì)胞凋亡。而許多補(bǔ)益類中藥能抑制細(xì)胞凋亡，如枸杞多糖能抑制地塞米松誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡，六味地黃湯能抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺淋巴細(xì)胞凋亡。成人繼發(fā)T細(xì)胞免疫缺陷癥用六味地黃湯 （丸）進(jìn)行滋陰補(bǔ)腎［2-3］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精，生髓通腦，故腦發(fā)育由腎所主。腎虛可導(dǎo)致腦發(fā)育障礙，應(yīng)用恐傷方法制作孕鼠腎精虧虛模型，經(jīng)熟地黃、枸杞子、制首烏、淫羊藿等組成的中藥補(bǔ)腎填精方煎劑灌胃治療恐傷孕鼠，結(jié)果模型組仔鼠海馬區(qū)腦組織Bcl-2陽性表達(dá)數(shù)下降、Bax陽性表達(dá)數(shù)升高，而補(bǔ)腎組則Bcl-2陽性表達(dá)數(shù)上升、Bax陽性表達(dá)數(shù)顯著下降 （P＜0.01）、仔鼠海馬區(qū)腦組織細(xì)胞凋亡率也顯著下降 （P＜0.05）［4］。中藥多糖作為中藥藥效成分之一，參與了機(jī)體的各種生命活動(dòng)，其中包括抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗衰老等，且毒副作用小，應(yīng)用前景非常廣闊。本文就中藥多糖成分抗缺血/缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制做一綜述。

1 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征

細(xì)胞凋亡時(shí)胞體縮小，胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性增大，細(xì)胞色素C釋放到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180～200 bp片段或其整數(shù)倍［5-6］。細(xì)胞在凋亡的整個(gè)過程中質(zhì)膜完整，細(xì)胞內(nèi)含物不外泄，不會(huì)發(fā)炎癥反應(yīng)。

2 腦缺血/缺氧與神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡途徑

腦血管痙攣、腦栓塞、甚至腦出血均能引起腦缺血/缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。目前缺血/缺氧或再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制還不是很清楚，但興奮性氨基酸釋放增加，如谷氨酸、天門冬氨酸［7-8］；細(xì)胞內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，如羥自由基、超氧陰離子［9］；細(xì)胞內(nèi)離子平衡被打破，如胞漿Ca2+增加［10］、Na+/K+-ATP酶活性下降所致的胞內(nèi)外Na+/K+平衡紊亂［11］；線粒體損傷，如膜通透性的改變導(dǎo)致細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等多種活性物質(zhì)泄入胞漿等［12］；凋亡相關(guān)基因表達(dá)失衡，如Bcl/Bax比值下降等均可能在凋亡過程中發(fā)生重要作用。并最終通過三條主要途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡：①外源性途徑：死亡受體如Fas、TNFR等在配體FasL、TNF-α刺激下，通過接頭蛋白 FADD將Caspase-8酶原招募到細(xì)胞質(zhì)膜上，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物DISC。Caspase-8酶原在這個(gè)復(fù)合物中被活化，進(jìn)而激活下游的Caspase蛋白家族并引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13-14］。②內(nèi)源性途徑：生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子，以及自由基、缺氧、病毒感染等非受體介導(dǎo)的凋亡刺激，引起B(yǎng)H3-only蛋白家族 （BAD、BIK、BID等）活化，導(dǎo)致線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放、膜電位下降，促使線粒體向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放細(xì)胞色素C、絲氨酸蛋白酶Omi以及其它凋亡誘導(dǎo)因子，釋放的細(xì)胞色素C與Apaf-1和Caspase-9前體形成凋亡復(fù)合物，并活化Caspase-9?；罨腃aspase-9激活下游的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，或者線粒體釋放的另外的凋亡因子EndoG，AIF［15-16］等，直接進(jìn)入細(xì)胞核，引發(fā)DNA斷裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡。③穿孔素-顆粒酶B途徑：顆粒酶B進(jìn)入細(xì)胞后直接裂解天門冬氨酸殘基活化Caspases蛋白［17］，促進(jìn)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。由此可見，細(xì)胞凋亡是多通路、多環(huán)節(jié)、多層次和高度復(fù)雜的可控過程，并且每一條途徑并不是孤立存在，而是相互交錯(cuò)，聯(lián)系在一起的。而中藥多糖具有多靶點(diǎn)、多途徑等中藥作用的典型特點(diǎn)，可以同時(shí)活化幾條抗凋亡通路，體現(xiàn)出抗凋亡作用的多樣性。

3 中藥多糖抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性凋亡作用及機(jī)制

不同種類的中藥多糖由于構(gòu)成其多糖的單糖種類和比例的不同，其分子量、空間結(jié)構(gòu)、溶解度，以及生物活性也不盡相同，并體現(xiàn)藥理作用的多樣性。中藥多糖成分不僅有抗輻射、抗炎癥、抗病毒［18］、抗凝血、抗腫瘤［19］、降血脂和血糖［20］，提高機(jī)體免疫還具有抗氧化和衰老，抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性損傷作用。

3.1 抗自由基損傷 自由基是細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的具有氧化活性的物質(zhì)，它能使細(xì)胞內(nèi)的生物大分子和細(xì)胞膜中的脂質(zhì)超氧化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損壞。細(xì)胞內(nèi)的自由基主要包括活性氧基團(tuán) （ROS）和活性氮基團(tuán) （RNS），如羥自由基與帕金森病 （Parkinson's disease）密切相關(guān)［21］。中藥多糖對(duì)自由基有很強(qiáng)地清除作用，刁波等［22］發(fā)現(xiàn)質(zhì)量終質(zhì)量濃度為2.5～10 mg/mL的刺五加多糖能夠有效地降低H2O2刺激的海馬神經(jīng)元丙二醛 （MDA）、ROS的水平并對(duì)海馬神經(jīng)元氧化損傷有保護(hù)作用。魏炳棟等［23］研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖、枸杞多糖和人參莖葉多糖均能有效地清除細(xì)胞內(nèi)的羥自由基，并且復(fù)合多糖較單一多糖具有更強(qiáng)的清除力，從而保護(hù)了細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞凋亡。馬慶華等［24］研究發(fā)現(xiàn)0.056 mg/mL白術(shù)多糖能夠使衰老大鼠大腦皮質(zhì)超氧化物歧化酶 （SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力增強(qiáng)，MDA水平降低，并有效地抑制DNA的損傷。由此可見，中藥多糖可以通過提高細(xì)胞SOD，谷胱甘肽 （GSH）的活性達(dá)到清除胞內(nèi)氧化自由基的目的，抑制氧自由基對(duì)線粒體膜和mtDNA的損傷，提高細(xì)胞對(duì)mtDNA的修復(fù)能力，抑制細(xì)胞凋亡［25］。

3.2 作用于細(xì)胞內(nèi)的信使 神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性損傷極易造成細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流和線粒體內(nèi)Ca2+的釋放，而游離的Ca2+可調(diào)節(jié)蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián)的受體及cAMP或cGMP、核酸內(nèi)切酶和磷酸水解酶的活性，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞、興奮性遞質(zhì)和氨基酸的增加、DNA的損傷等，中藥多糖對(duì)由這種途徑造成的細(xì)胞損傷有一定的抑制作用。汪茜等［26］參照改良的Longa線栓法建立大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠，在研究黃芪多糖對(duì)缺血缺氧腦損傷大鼠腦組織Ca2+和興奮氨基酸的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠明顯降低缺血缺氧損傷大腦組織中總Ca2+水平，緩解缺血/缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的進(jìn)一步損傷。體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞研究表明［27］，當(dāng)去除神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子后提高胞內(nèi)cAMP水平有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用。但也有研究表明細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的增加也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［28］。梁霜等［29］研究發(fā)現(xiàn)低劑量的玉郎傘多糖能夠提高大鼠大腦中cAMP的水平，而高劑量的玉郎傘多糖可以抑制cAMP的活性。一氧化氮 （NO）作為一種重要的氣體信號(hào)分子主要由神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，對(duì)維持海馬細(xì)胞的認(rèn)知能力具有重要的作用，而神經(jīng)一氧化氮合成酶 （nNOS）對(duì)大腦NO的合成起著決定性的作用，而NOS活性的增加引起線粒體能量障礙，線粒體中的細(xì)胞色素C水平增加并釋放到胞漿中，引起細(xì)胞凋亡［30］。研究表明刺五加多糖能夠明顯減低氧化損傷的海馬神經(jīng)元中NO的水平，其可能的機(jī)制是抑制了神經(jīng)元中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （iNOS）mRNA的表達(dá)［31］。

3.3 調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中Bcl-2蛋白家族起著重要的調(diào)控作用，而Bcl-2蛋白家族成員根據(jù)其功能分為Bcl-2，Bcl-x，Bcl-w等凋亡抑制分子和Bax，Bak，Bad，Bid等凋亡促進(jìn)分子。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部的 （如DNA損傷）或者外部的 （如藥物、自由基）刺激時(shí)，細(xì)胞將凋亡信號(hào)傳遞給線粒體后，引起線粒體膜通透性的改變，線粒體釋放大量的凋亡誘導(dǎo)因子 （如細(xì)胞色素C）到細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。而在抗凋亡的信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子-КB（NF-КB）處于中心位置，大腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞因子通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT活化NFКB，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活凋亡抑制因子，從而抑制細(xì)胞凋亡［32］。另一方面在促進(jìn)細(xì)胞凋亡的信號(hào)中，轉(zhuǎn)錄因子p53可以通過上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)或通過死亡信號(hào)受體蛋白途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［33］。研究表明黃芪多糖經(jīng)原位末端標(biāo)記法 （TUNEL）具有抗缺氧/缺血誘導(dǎo)的大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，免疫組化發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以抑制腦出血后核因子NF-КB的高表達(dá)，加速缺損的神經(jīng)功能恢復(fù)［34-35］。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)，Hoechst33342熒光染色，DNA電泳以及AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀測(cè)定等方法研究黃精多糖抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.5～1.5 mg/mL的黃精多糖具有明顯的抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性凋亡作用，并隨著質(zhì)量濃度的增加抗凋亡作用增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺氧前加入黃精多糖可以上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。由此可推測(cè)黃精多糖可能通過調(diào)節(jié)凋亡基因的表達(dá)，來調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值來實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡作用的［36-37］。蘆薈多糖抗腦缺血大鼠模型研究表明，蘆薈多糖給藥組與陽性組和模型組比較細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3表達(dá)量顯著下降 （P＜0.01），p53蛋白的表達(dá)量較模型組也顯著降低，說明蘆薈多糖可以通過抑制caspase-3蛋白、p53蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡［38-39］。

3.4 對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的影響 腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)中的兒茶酚胺、乙酰膽堿 （Ach）、γ-氨基丁酸 （GABA）、谷氨酸、組胺和小肽類等均對(duì)腦功能具有維持作用［40］。腦缺血/缺氧容易導(dǎo)致γ-氨基丁酸釋放減少 谷氨酸釋放增加，腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂［41］，而釋放的谷氨酸可以通過線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［42］。楊娟等［43］運(yùn)用神經(jīng)干細(xì)胞谷氨酸損傷模型模擬腦梗死中神經(jīng)元缺血缺氧性損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的刺梨多糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞谷氨酸損傷具有保護(hù)作用，推測(cè)其可能是抑制谷氨酸鈉所引起的Ca2+升高。張振東等［44］采用反復(fù)缺血/再灌注法造模，研究土黨參多糖對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，土黨參多糖能夠明顯降低小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷，并且中劑量的土黨參多糖能夠明顯抑制Ach水平的下降，高劑量的土黨參多糖能夠明顯降低乙酰膽堿酯酶 （AchE）的活性。由此可見，中藥多糖可以通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝平衡而達(dá)到保護(hù)腦損傷的目的。

3.5 作用于熱休克蛋白 腦缺血/缺氧或再灌注神經(jīng)細(xì)胞損傷后引起細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生熱休克蛋白抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的c-Jun N-terminal激酶 （JNKs）的激活，從而減少細(xì)胞凋亡［45］。有研究表明，缺血/缺氧再灌注1 h后熱休克蛋白70有高表達(dá)，而熱休克蛋白70合成的增加能減輕細(xì)胞的凋亡，并阻止細(xì)胞啟動(dòng)自殺途徑［46-47］。王志鵬等［48］運(yùn)用免疫組化和western-blot方法研究大黃多糖對(duì)腦損傷后大鼠腦皮層熱休克蛋白70表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃多糖可以促進(jìn)熱休克蛋白70的表達(dá)，啟動(dòng)內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制保護(hù)受損的腦組織，加快腦損傷的康復(fù)。可見中藥多糖可以促進(jìn)熱休克蛋白70的表達(dá)，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4 展望

雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分中藥多糖成分有一定的抗缺血/缺氧或再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，但仍缺乏不同藥性的中藥其多糖抗缺血/缺氧或再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用系統(tǒng)性研究，以及抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制系統(tǒng)研究。因此，進(jìn)一步深入對(duì)不同藥性的中藥其多糖進(jìn)行抗缺血/缺氧性神經(jīng)細(xì)胞凋亡的系統(tǒng)性研究十分必要，其將有助于中藥的開發(fā)應(yīng)用，以及疾病治療的新組方的創(chuàng)立和應(yīng)用，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化提供基礎(chǔ)。

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R285.5

A

1001-1528（2013）04-0815-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.043

2012-04-17

向 勤 （1985—），男，碩士生，研究方向：神經(jīng)修復(fù)與再生。Tel：13787093757，E-mail：xqlcjy@163.com

*通信作者：胡國(guó)柱 （1956—），男，研究員，研究方向：神經(jīng)修復(fù)與再生。E-mail：hgz56@126.com