郭 蒙，葉 華，朱宇珍，吳 瓊，鄭學(xué)寶

(廣東醫(yī)學(xué)院1.廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.藥理學(xué)教研室，廣東湛江 524023)

結(jié)腸癌是目前最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。迄今，全球結(jié)腸癌發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)[1]，調(diào)查顯示，我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率分別為28.08/10萬(wàn)和13.41/10萬(wàn)，占惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位和第5位[2]，已成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一。目前，實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)腸癌的造模方法大多數(shù)為移植瘤模型，選用無(wú)胸腺裸鼠，將腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行皮下移植或原位移植，此方法操作簡(jiǎn)單，周期短，成功率高，但是不能觀察到結(jié)腸癌形成過(guò)程，發(fā)展?fàn)顩r，轉(zhuǎn)移類別，且人類癌癥流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室癌癥動(dòng)物模型研究均表明，化學(xué)致癌劑是誘導(dǎo)人類癌癥發(fā)生的重要因素之一。因此，結(jié)腸癌化學(xué)造模方法是研究結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤藥物療效的重要工具，對(duì)結(jié)腸癌化學(xué)造模方法的探討具有重要意義。

1 化學(xué)致癌劑的種類

使用化學(xué)致癌劑在動(dòng)物上建立結(jié)直腸癌模型最早可追溯到20世紀(jì)50年代初期，Lorenz[3]報(bào)道用多環(huán)芳香烴化合物甲基膽蒽(methylcholanthrene)喂養(yǎng)的小鼠胃賁門(mén)部和腸道發(fā)生了腫瘤。1952年，Walpole等[4]發(fā)現(xiàn)給大鼠注射4-氨基聯(lián)苯和 3，2-二甲基-4-氨基聯(lián)苯(2，3'-dimethyl-4-aminobiphenyl，DMAB)可誘發(fā)大腸癌;1981年，日本學(xué)者將乙基硝基亞硝基胍(N-ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，ENNG)栓劑置入雜種犬肛門(mén)上15cm處的腸管進(jìn)行結(jié)腸癌造模，13個(gè)月后發(fā)現(xiàn)潰瘍及腸腺底癌灶形成。1967年，Druckrey 等[5]通過(guò) 1，2-二甲肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)誘導(dǎo)出大鼠腸道癌癥。1999年，Delker等[6]用氧化偶氮甲烷(azoxymethan，AOM)在近交小鼠中誘導(dǎo)出腸癌。這些模型不夠成熟，造模成功率低。

隨著化學(xué)造模方法研究的深入，使用二甲肼和氧化偶氮甲烷及其代謝物甲基偶氮甲烷(methylazoxymethanol，MAM)作為致癌劑的造模方法越來(lái)越成熟，成為目前最為常用的化學(xué)致癌劑。除此外還有雜環(huán)氨類化合物，如2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4，5-b]嘧啶(2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine，PhIP)和 2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]喹啉(2-amino-3-methylimidazo[4，5-f]quinoline，IQ);芳香胺類化合物，如3，2'-二甲基-4-氨基聯(lián)苯(DMAB);烷基亞硝酰胺類化合物，如甲基亞硝基胍(methylnitrosourea，MNU)和甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)等。通過(guò)光鏡分析發(fā)現(xiàn)，這些致癌物誘導(dǎo)的包括腫瘤在內(nèi)的上皮病變與人類結(jié)腸癌的病變具有相似性。許多在人類結(jié)腸癌上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞和生化的異常指標(biāo)都可以在結(jié)腸癌化學(xué)造模的動(dòng)物上找到，如花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝的異常，提高環(huán)氧酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的活性和伴隨產(chǎn)物前列腺素E2的生成，改變鳥(niǎo)氨酸脫氫酶活性和聚胺的水平，上游調(diào)節(jié)多種促炎因子的生成[7]，故能夠基于人類結(jié)腸癌中異常表達(dá)的蛋白在結(jié)腸癌化學(xué)誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中研究抗癌靶向藥物。由此看出，致癌物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型能很好的模擬人類結(jié)腸癌。

氧化偶氮甲烷及二甲肼作為致癌劑，致癌效果佳，器官選擇性好。二者在大鼠上造成的結(jié)直腸癌跟人的十分相似，只是缺少人結(jié)直腸癌的前期腺瘤和后期易轉(zhuǎn)移的特征。早期的研究使用二甲肼誘導(dǎo)結(jié)直腸癌，重復(fù)性好，二甲肼經(jīng)肝代謝產(chǎn)生DNA烷化劑氧化偶氮甲烷。二甲肼和氧化偶氮甲烷為間接致癌劑，本身不致癌，必須經(jīng)過(guò)代謝氧化脫烷基成甲基偶氮甲烷才具致癌作用。與二甲肼相比，氧化偶氮甲烷表現(xiàn)出更強(qiáng)的致癌作用，且使用劑量穩(wěn)定，已經(jīng)成為經(jīng)典的致癌劑，應(yīng)用非常廣泛[8]。二甲肼在代謝中大部分隨尿排出體外，氧化偶氮甲烷則不會(huì)。在致癌的生物靶向性方面，相比二甲肼，氧化偶氮甲烷能專一趨向特異器官。氧化偶氮甲烷易誘發(fā)末端結(jié)腸癌，其病理學(xué)和遺傳學(xué)改變與人散發(fā)性結(jié)腸癌極其相似[9]。

各種致癌劑的致癌效果有所不同，其成瘤率主要取決于給藥途徑、頻率、劑量、持續(xù)時(shí)間以及生物的性別、遺傳背景、周齡等。同時(shí)飲食、腸道菌群、免疫狀態(tài)等可通過(guò)干擾致癌劑的代謝來(lái)影響局部有效濃度，影響致癌效果。

2 給藥途徑的比較

化學(xué)致癌物造模的效果與給藥途徑有密切聯(lián)系，表現(xiàn)為其誘發(fā)結(jié)腸癌的概率有顯著差異。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大鼠口服二甲肼20 mg·kg－152周后發(fā)生結(jié)腸癌的概率為14%～30%;皮下注射氧化偶氮甲烷發(fā)生結(jié)腸腫瘤的概率為100%;直腸內(nèi)給二甲肼250 mg·kg－18周，在34周后發(fā)現(xiàn)結(jié)腸的輕微增生和癌前病變;每周肌內(nèi)注射氧化偶氮甲烷8 mg·kg－1，12周后發(fā)生結(jié)腸腫瘤的概率為80%[10]。每周腹腔注射氧化偶氮甲烷10 mg·kg－1，連續(xù)4周，在第24周發(fā)生結(jié)腸癌的概率為100%[11]。后來(lái)研究人員又發(fā)現(xiàn)了MNU及MNNG等亞硝胺類化合物動(dòng)物灌腸后能誘發(fā)大腸癌。直腸內(nèi)直接給予MNU后結(jié)腸癌的發(fā)生率為100%，并伴23%～31%的小鼠發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移[12]。PhIP與食物一同給予小鼠也有較好的致癌效果，400 mg·kg－1的PhIP在第52周可獲得55%的致癌率[13]，且PhIP的致癌效果與性別與種族有很大的聯(lián)系[14]。有報(bào)道中對(duì)二甲肼口服、皮下注射、胃內(nèi)埋線三種給藥方式進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)皮下注射成瘤率較其他給藥方式高。但在A/J小鼠中，皮下注射氧化偶氮甲烷的效果不如腹腔注射的效果，而對(duì)于SER/J小鼠沒(méi)有此區(qū)別[6]，說(shuō)明給藥途徑的成瘤效果跟小鼠的遺傳背景有密切聯(lián)系。近年研究較多且成瘤率高的給藥方式為腹腔注射，對(duì)不同劑量氧化偶氮甲烷的成瘤率和致死率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)連續(xù)4周腹腔注射氧化偶氮甲烷10 mg·kg－1為最佳的給藥劑量[6]。作者還指出，此最佳劑量與動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境無(wú)關(guān)，劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著的影響，劑量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡率升高，劑量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致癌癥程度較輕，不同的致癌劑的最佳劑量取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景和給藥方式，故需要試驗(yàn)者進(jìn)行摸索。

有報(bào)道指出，長(zhǎng)期的西化食物(包括高脂肪、高熱量、低鈣、低維生素D)飼養(yǎng)小鼠18個(gè)月后，在小鼠的小腸和結(jié)腸發(fā)現(xiàn)較多腫瘤[15]。亦有很多研究者通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸炎誘發(fā)結(jié)腸癌，Cooper等[16]用4%葡聚糖硫酸鈉造模，4 d的葡聚糖硫酸鈉加12 d的正常飲水為1個(gè)循環(huán)，1個(gè)循環(huán)和2個(gè)循環(huán)后的成癌率分別為22%和40%。結(jié)腸炎誘發(fā)結(jié)腸癌很好的模擬了人結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變，有很好的研究意義，但由于造模周期過(guò)長(zhǎng)，成瘤率低，采用者少。

研究人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，先腹腔注射15 mg·kg－1二甲肼1 周，再飲用 20 g·L－1的葡聚糖硫酸鈉1周，第4周后發(fā)現(xiàn)40%小鼠便血，13周后10%小鼠脫肛，20周后40%小鼠脫肛，100%的雄性ICR小鼠出現(xiàn)結(jié)腸癌[17]?；瘜W(xué)致癌劑和葡聚糖硫酸鈉的聯(lián)合應(yīng)用提高了致癌率，減少了誘導(dǎo)周期，而且可以觀察到結(jié)腸炎到結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程，為較為理想的化學(xué)造模方案，適用于相關(guān)預(yù)防和治療藥物的研究，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

小鼠的繁殖能力強(qiáng)，價(jià)格低廉，給藥劑量低，故結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究中多用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)用小鼠有多種類型:近交系(BALB/C、C57BL、A 系、C3H/HE、DBA 等)、遠(yuǎn)交系(KM、ICR、NIH、CFW、LACA 等)和突變系(NUDE、SCID、SAM等)。不同的小鼠由于遺傳背景不同故對(duì)致癌劑的敏感性不同，而對(duì)致癌劑的致癌效果產(chǎn)生很大影響。例如:A/J、P/J、STS/A和ICR/HA鼠對(duì)二甲肼的致癌作用高度敏感，BALB/CHEA和SWM/J鼠敏感性較弱，AKR/J和DBM/2J鼠則表現(xiàn)出相對(duì)的耐藥性[18]。A/J、SWR/J鼠對(duì)氧化偶氮甲烷有很強(qiáng)的敏感性。

有報(bào)道用氧化偶氮甲烷10 mg·kg－1對(duì)SWlR/J，A/J和AKR/J三種小鼠進(jìn)行腹腔注射，每周1次，總計(jì)6周，發(fā)現(xiàn)AKR/J小鼠未誘發(fā)出大腸腫瘤，而另兩種小鼠則在第6周有大腸腫瘤形成[19]。相關(guān)的研究也指出，A/J小鼠有高度的結(jié)腸癌敏感性，SWIR/J小鼠其次，AKR/J小鼠對(duì)氧化偶氮甲烷的致癌作用有抵抗性。這些說(shuō)明致癌劑的致癌效果跟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳背景有密切聯(lián)系，其中氧化偶氮甲烷作為腫瘤發(fā)生的激活劑，也能在一定遺傳背景的基礎(chǔ)上促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

ICR小鼠接受一次腹腔注射氧化偶氮甲烷(10 g·kg－1)，1 周后，再飲用葡聚糖硫 20 g·L－1酸鈉 1 周，20周后發(fā)現(xiàn)成瘤率100%[20]。在4種近交系小鼠(BALB/C，C57BL/6N，C3H/HEN和DBA/2N)上使用這種造模方法，發(fā)現(xiàn)BALB/C小鼠與ICR小鼠有相同的作用，對(duì)氧化偶氮甲烷最敏感，C57BL/6N小鼠其次，而其他2種小鼠對(duì)氧化偶氮甲烷表現(xiàn)出一定的耐藥性[21]。證明了小鼠遺傳背景的不同能對(duì)致癌劑的致癌效果產(chǎn)生巨大的影響，作者還指出這是由于不同遺傳背景的小鼠在炎癥時(shí)期所具有的亞硝化能力不同多導(dǎo)致的。

分子生物學(xué)研究證實(shí)某些基因的突變或表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸癌的產(chǎn)生，遺傳突變包括癌基因激活(K-Ras、C-myc、EGFR)、抑癌基因失活(APC、DCC、p53)、錯(cuò)配修復(fù)基因突變(MMR、HLH1、PMS1、PMS2、GTBP)及危險(xiǎn)修飾基因(COX-2、CD44v)。人類結(jié)腸癌主要的遺傳疾病包括遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，NHPCC)(5%～13%)和家族性腸息肉病 (1%)。隨著基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，基因打靶和基因剔除技術(shù)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)研究中得到了大力的發(fā)展。如APC基因突變系小鼠，p53基因敲除小鼠，IL-10基因敲除小鼠，Gαi2基因敲除小鼠等，轉(zhuǎn)基因小鼠有自發(fā)結(jié)腸炎與結(jié)腸癌的趨向，表現(xiàn)為多發(fā)性小腸息肉和結(jié)腸炎癥，在藥物或飲食干預(yù)下轉(zhuǎn)基因小鼠更易誘導(dǎo)出結(jié)腸癌。如APC min+/－小鼠給予4%DSS 4 d，然后正常飲水17 d為一個(gè)循環(huán)，4個(gè)循環(huán)后小鼠的腸成瘤率100%[22]。有學(xué)者給C57BL/6N小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸注射帶有APC基因突變病毒，6周后71%的小鼠誘發(fā)了腺瘤，18周后4%的腺瘤發(fā)展為腸癌[23]。p53基因敲除小鼠給予4%葡聚糖硫酸鈉3個(gè)循環(huán)后結(jié)腸癌發(fā)病率為53.9%[24]。通過(guò)分子生物學(xué)的技術(shù)改變某些基因或干擾其表達(dá)，可達(dá)到良好的效果，在研究致癌基因方面有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，為結(jié)腸癌動(dòng)物模型的研究開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的天地。

4 化學(xué)致癌劑導(dǎo)致癌變的機(jī)制

1979年，戴乾圜等提出化學(xué)致癌機(jī)理的雙區(qū)理論:環(huán)境致癌劑代謝成特定的雙官能烷化劑，并通過(guò)誘發(fā)DNA互補(bǔ)堿基交聯(lián)和股間交聯(lián)而啟動(dòng)癌變。DNA互補(bǔ)堿基共價(jià)交聯(lián)啟動(dòng)的突變，是化學(xué)致癌劑誘發(fā)癌變的第一步。他證實(shí)了化學(xué)致癌劑、物理致癌因子和內(nèi)源性致癌物質(zhì)均首先引起DNA互補(bǔ)堿基的交聯(lián)，而互補(bǔ)堿基的交聯(lián)可高效率地引起基因的起始突變即沿DNA雙股的點(diǎn)突變或移碼變異，然后起始突變經(jīng)歷潛伏期，受被激活的逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制激發(fā)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的深度突變即產(chǎn)生各種奇異染色體并引起細(xì)胞的癌變[25－26]。

人類的結(jié)腸癌，包括自發(fā)性結(jié)腸癌，致癌劑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌，遺傳性非息肉性結(jié)腸癌，和結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌，每一種都受不同的分子通路主導(dǎo)調(diào)控，且伴有相關(guān)的基因突變，這些突變基因包括K-Ras、APC、p53和 β聯(lián)蛋白等[27]?；瘜W(xué)致癌劑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中有大量與人類相同的基因突變和遺傳通路的改變。Endo等[28]的研究指出，二甲肼誘導(dǎo)的結(jié)腸癌中有57%的K-Ras基因突變。在氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的結(jié)腸癌中，K-Ras基因突變頻率高，而APC和p53的突變頻率低[29]。相反，在PhIP、MNU和MNNG誘導(dǎo)的結(jié)腸癌中，其目標(biāo)基因?yàn)锳PC和p53，K-Ras基因突變頻率低[13]。Wnt/APC/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路在化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌中有重要地位，且氧化偶氮甲烷、二甲肼、IQ和PhIP誘導(dǎo)的結(jié)腸癌中均有β聯(lián)蛋白基因的突變，β聯(lián)蛋白的表達(dá)異常與不典型增生和癌變有關(guān)?；瘜W(xué)致癌劑是通過(guò)引起特定基因的突變，細(xì)胞突變的積累過(guò)度最終達(dá)到致癌效果。

有學(xué)者在IL-10敲除和野生型小鼠上使用氧化偶氮甲烷刺激誘發(fā)結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)只有基因敲除的小鼠有結(jié)腸癌的陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明炎癥微環(huán)境在癌癥的發(fā)生發(fā)展上起重要作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，癌前病變的微環(huán)境中伴有大量炎性細(xì)胞、炎性因子及趨化因子的浸潤(rùn)，其浸潤(rùn)程度與腫瘤惡性程度相關(guān)[31]。在實(shí)驗(yàn)的研究中氧化偶氮甲烷增加結(jié)直腸瘤中COX-2的表達(dá)[32]，抑制腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β受體2的表達(dá)[8]，激活表皮生長(zhǎng)因子的固有的酪氨酸激酶[33]，核轉(zhuǎn)錄因子κB作為多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在炎癥與腫瘤之間也有重要的橋梁作用[34]，說(shuō)明致癌劑在誘導(dǎo)結(jié)腸癌的過(guò)程中不同程度上刺激免疫系統(tǒng)，激活了炎癥反應(yīng)，從而在促進(jìn)了癌癥的發(fā)生。

5 小結(jié)

由于結(jié)腸癌的發(fā)病率越來(lái)越高，在臨床上迫切的需要提高結(jié)腸癌的診斷指標(biāo)，充分了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，分析病因和尋找療效藥，解決各個(gè)階段病人的需要?；瘜W(xué)造模方法能有效的模擬由腺瘤發(fā)展為惡性腫瘤的癌變過(guò)程，有利于研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的病理病機(jī);基因重組、基因改造在模型上的應(yīng)用，有利于研究結(jié)腸癌相關(guān)的基因信息;能在不同遺傳背景的動(dòng)物上進(jìn)行結(jié)腸癌的復(fù)制，有利于研究腫瘤的化學(xué)預(yù)防和飲食因素，對(duì)結(jié)腸癌的研究有很好的推動(dòng)作用。但結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，要結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)選擇適合的造模方法。盡管我們研究并應(yīng)用的化學(xué)致癌劑的種類、癌癥相關(guān)的基因有限，但隨著各種化學(xué)造模方法的應(yīng)用，結(jié)腸癌的深入研究，造模方法將得到完善，癌癥相關(guān)的基因?qū)⒗^續(xù)被發(fā)現(xiàn)，理想的治療藥物也會(huì)被找到。

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