趙元淑，羅淼珊，鄧 鎮(zhèn)，謝 柳，余 涵，胡景鑫，朱曉琴，雷水生

顳葉癲癇是難治性癲癇的一種，主要病理表現為海馬硬化和神經元丟失。傳統(tǒng)的手術治療會出現言語記憶減退等副作用［1］。研究表明細胞移植可以產生顯著的療效［2］。γ-氨基丁酸(GABA)是腦內重要的抑制性神經遞質，具有抑制癲癇發(fā)作的作用。谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA 合成的唯一的限速酶，GAD 的含量和活性直接決定GABA 的濃度。GAD65 是GAD 的一種亞型，在發(fā)揮持續(xù)抑制、調節(jié)癲癇活動中起重要作用［3］。提高腦內GAD65 的濃度可以促進GABA 的生成，而使用GAD65 修飾的骨髓間充質干細胞移植治療癲癇尚未見報道。本實驗構建了GAD65 真核表達載體，轉染大鼠骨髓間充質細胞，并對其在細胞中的表達做了初步鑒定，為進一步干細胞移植奠定了實驗基礎，為基因治療和細胞移植聯合治療癲癇提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 真核表達載體pCDNA3.1 購于深圳百恩維公司，大腸桿菌DH5α 購于天根生化公司，小量質粒抽提試劑盒購于北京全式金生物公司，限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 連接酶購于美國NEB 公司，RNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒購于Takara，Lip2000、Trizol 購于Invitrogen，一抗來自Abcam;二抗購于北京中杉金橋，胎牛血清FBS、低糖DMEM 購于Gibco。動物:成年SD 大鼠及4 周齡SD大鼠，由廣州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 pCDNA3.1-GAD65 真核表達載體構建及鑒定 成年SD 大鼠腦組織50mg，液氮中研磨，按Trizol 說明書步驟提取鼠腦總RNA。以鼠腦總RNA為模板，以Oligo(dT)為引物，逆轉錄生成GAD65 的cDNA。根據Genbank 提供的大鼠GAD65 編碼序列設計引物。上游引物5’-AGTGAATTCAGAACCCATGGCATGGCATCTCC-3’，下游引物5’-CGTCCAGCTCGAGCAAAGTGATTACAA-3’。上下游引物分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點。以cDNA 為模板，用高保真DNA 聚合酶對GAD65 基因進行擴增。PCR 擴增條件:94℃預變性4min，94℃30s，59℃3min，37 個循環(huán)，最后72℃延伸8min。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。EcoRⅠ、XhoⅠ酶切GAD65 和pCDNA3.1 真核表達載體，回收目的基因片段和pCDNA3 真核質粒片段。用T4 連接酶將上述兩片段定向連接，連接產物轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將轉化后的菌液涂布于LB 瓊脂平板上，挑取白色克隆接種在LB 培養(yǎng)基中。抽提重組質粒，該質粒命名為pCDNA3.1-GAD65。用限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切該質粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送上海英濰捷基公司測序。

1.2.2 大鼠骨髓間充質干細胞細胞分離培養(yǎng)及轉染 取4w 健康雄性SD 大鼠1 只，脫頸處死后浸泡于75%酒精中5min，于無菌條件下取出雙側股骨、脛骨，迅速放于PBS 中，剪除骨膜及軟組織(盡量剪干凈)，切斷干骺端，暴露骨髓腔，取5ml 注射器吸取培養(yǎng)液(10%FBS，1%雙抗，90%DMDM)反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白為止。將沖洗液反復吹打均勻，接種于100mm 平皿，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中。24h、48h 全換液，以后隔天全換液。5～7d細胞長滿平皿底，細胞達到90%融合時用胰酶消化，1∶2 傳代。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，2～3d 傳代一次。轉染前一天將P3 代細胞接種于六孔板中以備轉染。將待轉染的BMSCs 分成3 組:A組:轉染pCDNA3.1-GAD65 組;B 組:轉染空質粒pCDNA3.1 組;C 組:未轉染組。將DNA 和脂質體按1∶3 的比例分別加入250μl 無血清培養(yǎng)基Optimem 中，混合反應20min;吸出培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗兩遍，加入1.5ml Opti-mem，將DNA、脂質體混合液加入6 孔板(C 組只加無血清培養(yǎng)基)，反應6h 后，吸出轉染液，加入正常培養(yǎng)液;細胞培養(yǎng)48h 后進行各項指標檢測。

1.2.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測mRNA 表達 吸出細胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗一遍，加入1ml Trizol，提取總RNA，按逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄成cDNA;以cDNA 為模板，上游引物5’-ACGCACTGCCAAACAACTCTA-3’，下游引物5’-GACATCAGTAACCCTCCACCC-3’進行熒光定量PCR。擴增條件:95℃30s;95℃5s;60℃34s;共40 個循環(huán)。溶解曲線設置為:95℃ 15s;60℃ 1min;95℃15s。用△△CT 值比較法處理數據。

1.2.4 免疫熒光檢測BMSCs 中GAD65 的表達 吸出細胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 遍，冰甲醇固定10min，0.3%TritonX-100 室溫通透10min，山羊血清室溫封閉30min，一抗4℃封閉過夜，次日復溫30min 后;二抗37℃避光孵育2h，DAPI 染核，5%甘油封片鏡檢。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達 細胞轉染48h 后吸出培養(yǎng)液，用預冷PBS 沖洗3 遍，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取適量蛋白行SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白用濕法轉膜轉印到PCDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃封閉過夜，TBST 洗膜，加入二抗室溫孵育1h，TBST洗膜，ECL 發(fā)光顯影。

2 結果

2.1 pCDNA3.1-GAD65 真核表達載體構建及鑒定 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結果顯示:1～4 泳道均顯示擴增出1758bp 大小的目的基因片段和大小為5428bp 的pCDNA3.1 基因片段，與預期大小一致。將菌落PCR 和重組質粒雙酶切鑒定均為陽性的克隆送往公司測序，并與Genbank 中GAD65 的基因序列比對。測序結果顯示，目的基因序列與NCBI 公布的參考序列完全一致，無讀碼框移，以上結果證明pCDNA3.1-GAD65 重組真核質粒構建成功。

2.2 RT-PCR 檢測轉染后BMSCs 中GAD65 mRNA 的表達 細胞轉染24h 后，提取各組細胞總RNA，檢測GAD65 mRNA 在各組骨髓間充質干細胞中的表達。實時熒光定量PCR 檢測結果顯示:pCDNA3.1-GAD65 轉染組的GAD65 mRNA(203911.668±16064.279)較未轉染組(0.835±0.183)和pCDNA3 空質粒轉染組(0.461±0.129)有明顯的升高(P＜0.05)，而未轉染組和pCDNA3.1 空質粒轉染組相比，差異不顯著，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 免疫熒光檢測BMSCs 中GAD65 的表達免疫熒光檢測各組GAD65 蛋白表達情況，并且初步估計轉染率。pCDNA3.1-GAD65 轉染組顯示GAD65 蛋白在細胞漿內均勻表達，而未轉染組、pCDNA3.1 空質粒轉染組未見GAD65 表達。這證明pCDNA3.1-GAD65 能夠成功地被轉染到骨髓間充質干細胞中，并正確過表達目的蛋白。

2.4 Western blot 檢測BMSCs 中GAD65 的表達 Western blot 檢測pCDNA3.1-GAD65 轉染組、pCDNA3.1 空質粒轉染組、未轉染組GAD65 蛋白表達情況。結果顯示pCDNA3.1-GAD65 轉染組過表達GAD65 蛋白，而pCDNA3.1 空質粒轉染組、未轉染組未檢測到GAD65 蛋白表達。

3 討論

癲癇是由于大腦神經元突發(fā)性異常放電導致大腦功能障礙的一種慢性疾病。癲癇的發(fā)作與中樞神經系統(tǒng)中神經遞質的興奮-抑制失衡有關［4～6］。部分難治性癲癇患者可以接受手術治療，但并非所有難治性癲癇患者都適宜手術，特別是癲癇灶彌散或不明確者并不具備傳統(tǒng)手術的手術指征，而且傳統(tǒng)手術遠期療效只有60%左右，因此有必要探索更安全、更有效的新治療方案。

近年來，干細胞移植治療癲癇的方法越來越獲得關注，因為干細胞具有產生內源性抗驚厥物質、替換損傷神經元的作用，可以用于癲癇的治療［7，8］。但是，由于胚胎干細胞、神經干細胞等在取材方面存在限制，嚴重影響了其在臨床中的應用。骨髓間充質干細胞(BMSCs)免疫原性小，取材方便，能誘導分化成骨軟骨、脂肪、心肌、神經元等各種細胞［9］。這些特點讓骨髓間充質干細胞在科學實驗和臨床治療中獲得更多的應用［10］。骨髓間充質干細胞移植已經在治療脊髓損傷和自身免疫性疾病方面取得了顯著的治療效果［11，12］。因此，骨髓間充質細胞在移植中可以作為一個理想的種子細胞。

γ-氨基丁酸(GABA)是腦內一種重要的抑制性神經遞質，癲癇的反復發(fā)作可以引起腦內GABA 能神經元缺失，從而導致不同程度的癲癇發(fā)作［13］。向腦內定向移植GABA 能細胞可以抑制癲癇的發(fā)作。谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA 合成的限速酶，其存在兩種異構體，即GAD65 和GAD67。GAD65 主要存在于神經突觸中，GAD67 則均勻地分布于神經元的胞體。兩種異構體由于活化和細胞定位不同而被賦予不同的功能。GAD67 基因敲除的小鼠先天發(fā)育異常，出生后不久死亡;而GAD65 基因敲除的小鼠出現癲癇自發(fā)性發(fā)作［14］。因此，GAD65 在癲癇的發(fā)作中具有重要的作用。GAD65 基因修飾BMSCs 可以在短時間內產生高濃度的GAD65，移植GAD65-BMSCs 可以起到補充GABA 能細胞的作用。

通過基因工程化細胞治療疾病是近期研究的熱點。將基因轉染入特定的細胞中，使其過表達或沉默某種基因，從而達到治療疾病的目的。本實驗將GAD65 基因導入骨髓間充質干細胞，以期注入腦內產生高濃度的抑制性神經遞質GABA，從而達到治療癲癇的目的。

在實驗中我們依據真核質粒安全、無病毒突變危險、可以應用于臨床等優(yōu)點，構建pCDNA3.1-GAD65 真核載體，并將其轉染大鼠骨髓間充質干細胞，通過RT-PCR、免疫熒光、Western-blot 等鑒定，證實GAD65 基因在轉染的細胞中能夠正確表達，這為進一步探索攜帶GAD65 的骨髓間充質干細胞治療癲癇奠定了前期實驗基礎。

［1］Wilson CL，Maidment NT，Shomer MH，et al.Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic，kainate rat model of hippocampal epilepsy［J］.Epilepsy Res，1996，26(1):245－254.

［2］Simantov R，Crispino M，Hoe W，et al.Changes in expression of neuronal and glial glutamate transporters in rat hippocampus following kainate-induced seizure activity［J］.Brain Res Mol Brain Res，1999，65(1):112－123.

［3］Friedman LK，Pellegrini-Giampietro DE，Sperber EF，et al.Kainateinduced status epilepticus alters glutamate and GABAA receptor gene expression in adult rat hippocampus:an in situ hybridization study［J］.J Neurosci，1994，14(1):2697－2707.

［4］Walls AB，Nilsen LH，Eyjolfsson EM，et al.GAD65 is essential for synthesis of GABA destined for tonic inhibition regulating epileptiform activity［J］.J Neurochem，2010，115(6):1398－1408.

［5］Gleissner U，Helmstaedter C，Schramm J，et al.Memory outcome after selective amygdalohippocampectomy:a study in 140 patients with temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2002，43(1):87－95.

［6］Turner DA，Shetty AK.Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy［J］.Neurosurgery，2003，52(3):632-644.

［7］Raedt R，Boon P.Cell therapy for neurological disorders:a comprehensive review［J］.Acta Neurol Belg，2005，105(3):158－170.

［8］Madhavan L，Collier TJ.A synergistic approach for neural repair:cell transplantation and induction of endogenous precursor cell activity［J］.Neuropharmacology，2010，58(6):835－844.

［9］胡資兵，曾 榮，郭偉韜，等.骨髓間充質干細胞誘導分化特征［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008(43):8561－8566.

［10］Ding DC，Shyu WC，Lin SZ.Mesenchymal stem cells［J］.Cell Transplant，2011，20(1):5－14.

［11］Uccelli A，Prockop DJ.Why should mesenchymal stem cells(MSCs)cure autoimmune diseases［J］.Curr Opin Immunol，2010，22(6):768－774.

［12］Vaquero J，Zurita M.Functional recovery after severe CNS trauma:current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells［J］.Prog Neurobiol，2011，93(3):341－349.

［13］Loscher W，Schwark WS.Evaluation of different GABA receptor agonists in the kindled amygdala seizure model in rats［J］.Exp Neurol，1985，89(2):454－460.

［14］Kash SF，Johnson RS，Tecott LH，et al.Epilepsy in mice deficient in the 65-kDa isoform of glutamic acid decarboxylase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(25):14060－14065.