李曉娟，郭直岳，王亞莉，趙建華，白瑞櫻，路承彪

研究表明，ATP 不僅是組織細(xì)胞的供能物質(zhì)，還是一種具有興奮性作用的神經(jīng)遞質(zhì)，能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速的神經(jīng)傳遞。神經(jīng)末梢突觸囊泡內(nèi)儲(chǔ)存著ATP 并能在特定的刺激下釋放［1］。正常情況下，釋放到胞外的ATP 量很少，當(dāng)腦受到損傷(如缺血缺氧)時(shí)，大量ATP 釋放到胞外，使胞外的ATP 水平迅速升高，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，繼而引發(fā)系列反應(yīng)，使細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡壞死，引起繼發(fā)性腦損傷［2］。ATP 受體屬于P2 嘌呤能受體，分為P2X 受體和P2Y 受體兩類。P2X 受體是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道蛋白，允許一價(jià)陽(yáng)離子如Na+和K+及二價(jià)陽(yáng)離子如Ca2+通過(guò)。P2Y 受體是G-蛋白耦聯(lián)的代謝型受體，該受體激活磷脂酶C(PLC)，導(dǎo)致鈣從肌漿網(wǎng)中釋放。

Glu 是人腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸。正常情況下，谷氨酸參與多種生理功能的調(diào)控，但過(guò)量的谷氨酸對(duì)神經(jīng)元有損傷作用。許多病理情況如缺血、癲癇、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茲海默癥和帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥)等都與谷氨酸興奮毒性介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)［3］，Glu 受體有3 種，分別是NMDA、KA 和AMPA 受體。Glu 受體的過(guò)度激活引起Ca2+內(nèi)流增加被認(rèn)為與這些病理改變有關(guān)。

Paul Brown［4］等發(fā)現(xiàn)，除了作為快速神經(jīng)遞質(zhì)外，ATP 還作為神經(jīng)系統(tǒng)一種興奮性谷氨酸能突觸所激活的產(chǎn)物，表明二者之間有一定的聯(lián)系。在大鼠皮層和海馬的錐體細(xì)胞中，P2 嘌呤能受體拮抗劑能改變谷氨酸的NMDA、KA 或AMPA 受體。近期的研究表明P2X 受體和AMPA 受體共同存在于小腦和海馬的興奮性突觸后膜上，在興奮性突觸上P2X 受體亞基的出現(xiàn)表明谷氨酸能和嘌呤能傳遞之間存在相互作用［5］。

因此本研究假設(shè)ATP 信號(hào)通路可能改變了神經(jīng)退行性變的過(guò)程，研究采用ATP、Glu 單獨(dú)或共同處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元觀察細(xì)胞死亡情況，通過(guò)全細(xì)胞電壓鉗放大器記錄海馬神經(jīng)元電流變化，探討胞外ATP、Glu 對(duì)海馬神經(jīng)元的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 孕鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物中心［許可證號(hào):scxk(豫)2005-0001］;ATP、glutamate、谷氨酰胺、胰蛋白酶均購(gòu)自Sigma 公司;DMEM、NB(neurobasal)、B27 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Gibco 公司;Axon 全細(xì)胞電壓鉗放大器購(gòu)自Molecular Device。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)［6］及實(shí)驗(yàn)分組 孕18d 胎鼠迅速取出海馬組織，置于D-Hanks 液中洗滌3 次，剪碎加入終濃度0.125%胰蛋白酶消化液中，37℃消化20min，用含10% 胎牛血清的冰冷DMEM 液中止消化，靜置2min 去除中止液，加入DMEM 液制成7×105cells/L 密度的細(xì)胞懸液，接種于涂有0.05%多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中(35mm)，6h后更換NB+B27+谷氨酰胺培養(yǎng)基，3d 后半量換液，37℃恒溫CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至第7 天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、ATP 組、Glu 組和ATP+Glu 組。正常對(duì)照組:NB+B27 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);ATP 組:更換為特定濃度的ATP 工作液后觀察;Glu 組:更換為特定濃度的Glu 工作液后觀察;ATP+Glu 組:更換為特定濃度的ATP+Glu 工作液后觀察。

1.2.2 海馬神經(jīng)元存活率檢測(cè) 用0.125%的胰蛋白酶消化貼壁的神經(jīng)元，并用含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中止消化，充分吹打細(xì)胞懸液，取9 滴細(xì)胞懸液移入試管中，加1 滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，3min 內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞(藍(lán)染細(xì)胞)。神經(jīng)元存活率=未藍(lán)染細(xì)胞/(藍(lán)染細(xì)胞+未藍(lán)染細(xì)胞)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 全細(xì)胞或膜外面向外式膜片鉗記錄同先前使用方法［7］。打開(kāi)數(shù)模轉(zhuǎn)換器和膜片鉗放大器，通過(guò)顯微鏡和CCD 可視下挑選狀態(tài)較好、突觸完整、邊界折光度好的神經(jīng)元;電極電阻大約為3-5M，高阻抗封接，形成全細(xì)胞記錄模式。應(yīng)用膜片鉗放大器記錄電流，2kHz 濾波，采樣頻率為5kHz(Digidata 1320，Axon Instruments)，pCLAMP-8 型軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)均采用SPSS13.0軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 ATP 和Glu 對(duì)細(xì)胞死亡率的影響 相差顯微鏡顯示正常培養(yǎng)條件下。海馬神經(jīng)元折光性強(qiáng)，胞體飽滿，有明顯的立體感，周圍有一圈亮?xí)?，神?jīng)突起多并延長(zhǎng)交織成網(wǎng)狀。采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理后，觀察到明顯神經(jīng)元細(xì)胞死亡，細(xì)胞形態(tài)變圓，突起變短，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率，對(duì)照組存活率在90%以上，采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元24h。單獨(dú)給予低劑量ATP 引起大約30%的神經(jīng)元死亡，單獨(dú)給予Glu 引起大約50%的神經(jīng)元死亡，ATP 和Glu 聯(lián)合給予引起接近100% 神經(jīng)元死亡(P＜0.05)。

2.2 ATP 和Glu 誘導(dǎo)的全細(xì)胞電流 在離體培養(yǎng)7d 的海馬神經(jīng)元上，固定膜電位在－70mV，記錄全細(xì)胞電流。低劑量ATP(100μmol/L)誘導(dǎo)的電流很微弱，Glu(100μmol/L)可誘導(dǎo)約300pA 的內(nèi)向電流(P＜0.05)，ATP(100μmol/L)和Glu(100μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)較大的內(nèi)向電流(P＜0.05)。三者之間的比較，表明ATP 提高了谷氨酸誘導(dǎo)的電流。

2.3 膜外面向外式(outside-out)膜片鉗記錄ATP 和Glu 誘導(dǎo)的離子電流 在全細(xì)胞記錄完成后，開(kāi)始膜片鉗記錄。單獨(dú)應(yīng)用ATP(100μmol/L)沒(méi)有誘導(dǎo)明顯的內(nèi)向電流，單獨(dú)應(yīng)用Glu(100μmol/L)誘導(dǎo)了微弱的內(nèi)向電流，二者同時(shí)使用誘導(dǎo)了較大的內(nèi)向電流(P＜0.05)，表明ATP 提高了Glu 誘導(dǎo)的內(nèi)向電流。

3 討論

興奮性毒性是由興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)受體的過(guò)度持續(xù)活化導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡過(guò)程［8］。20 世紀(jì)50 年代Holtol 發(fā)現(xiàn)感覺(jué)神經(jīng)興奮時(shí)釋放ATP，首次證實(shí)了ATP 可以作為神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)，提示ATP 在神經(jīng)興奮傳遞中具有實(shí)際意義。ATP 與離子門控型P2X 受體結(jié)合可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，促使大量Ca2+內(nèi)流，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡［2］。谷氨酸作為人腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸，當(dāng)其NMDA 受體過(guò)度興奮時(shí)大量Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，引起Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而激活依賴于鈣的酶系統(tǒng)引起一系列的細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到ATP 及Glu 作用于海馬神經(jīng)元后，細(xì)胞形態(tài)變圓，突起變短。臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)顯示，ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理后海馬神經(jīng)元死亡率依次增加，表明ATP 受體通道激活與Glu 對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷有協(xié)同作用。為進(jìn)一步探討ATP 與Glu 對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷機(jī)制，我們應(yīng)用全細(xì)胞電壓鉗放大器，單獨(dú)給予ATP 與Glu 或聯(lián)合誘導(dǎo)全細(xì)胞電流和膜片鉗記錄電流。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，單獨(dú)給予100μmol/L ATP 沒(méi)有明顯的電流產(chǎn)生，可能與使用的ATP 劑量低有關(guān)，Skaper 等［2］報(bào)道ATP 引起的細(xì)胞死亡多為mmol 的劑量，而我們使用的劑量為μmol/L 級(jí)的;100μmol/L Glu 可誘導(dǎo)較大的內(nèi)向電流;二者共同作用增加了電流大小，表明ATP 與Glu 的協(xié)同作用。

Domercq 等［9］報(bào)道腦缺血損傷是由于ATP 失穩(wěn)態(tài)。腦缺血時(shí)ATP 釋放增多，激活P2X7 受體導(dǎo)致顯著的鈣超載，是卒中等缺血性疾病的關(guān)鍵。脊髓創(chuàng)傷［10］也與ATP 受體P2X7 激活導(dǎo)致的興奮性毒性有關(guān)，應(yīng)用P2X7 抑制劑可減輕脊髓損傷。

谷氨酸引起的神經(jīng)元損傷更是被人們所公認(rèn)作為興奮性神經(jīng)毒性模型復(fù)制的方法［11］。Eftinija等［12］報(bào)道體外培養(yǎng) Schwann 細(xì) 胞，給 予 ATP(100μmol/L)引起受體介導(dǎo)的興奮性遞質(zhì)谷氨酸和天冬氨酸增加，提示在膠質(zhì)細(xì)胞中ATP 可以提高谷氨酸濃度，這與我們?cè)诤ｑR神經(jīng)元培養(yǎng)中觀察到的ATP 受體通道激活增加谷氨酸對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷結(jié)果是一致的。但是關(guān)于兩種興奮性遞質(zhì)對(duì)神經(jīng)元的共同作用并未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ATP 和Glu 可能同時(shí)打開(kāi)各自的受體通道導(dǎo)致更顯著的鈣超載，從而引起更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。

探討ATP 和Glu 對(duì)神經(jīng)元的作用，對(duì)與興奮毒性有關(guān)的紊亂諸如卒中等缺血性疾病、癲癇、阿爾茲海默癥和帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制可能提供重要證據(jù)。在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在這兩種受體通道的同時(shí)打開(kāi)，從多個(gè)通道進(jìn)行阻斷可能成為治療這些疾病的新的靶點(diǎn)。

［1］劉 秀.ATP 的神經(jīng)遞質(zhì)作用［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1996，27(2):167－169.

［2］Skaper SD，Debetto P，Giusti P.The P2X7 purinergic receptor:from physiology to neurological disorders［J］.FASEB J，2010，24(2):337－345.

［3］Ankarcrona M，Dypbukt JM，Bonfoco E，et al.Glutamate-induced neuron death:a succession of necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function［J］.Neuron，1995，15(4):961－973.

［4］Brown P，Dale N.Spike-independent release of ATP from Xenopus spinal neurons evoked by activation of glutamate receptors［J］.J Physiol，2002，540(3):851－860.

［5］Kimelberg HK.Increased release of excitatory amino acids by the actions of ATP and peroxynitrite on volume-regulated anion channels(VRACs)in astrocytes［J］.Neurochem Int，2004，45(4):511－519.

［6］Yu Z，Liu J，Guo S.et al.Neuroglobin-overexpressional alters hypoxic response gene expression in primary neuron culture following oxygen glucose deprivation［J］.Neuroscience，2009，162(2):396－403.

［7］Lu CB，Hamilton JB，Powell AD，et al.Effect of ageing on CA3interneuron sAHP and gamma oscillations is activity-dependent［J］.Neurobiology of Aging，2011，32(5):956－965.

［8］王松鶴，李 俐.興奮性神經(jīng)毒性及作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2009，21(8):910－914.

［9］Domercq M，Perez-Samartin A，Aparicio D，et al.P2X7 receptors mediate ischemic damage to oligodendrocytes［J］.Glia，2010，58(6):730－740.

［10］Peng W，Cotrina ML，Han X，et al.Systemic administration of an antagonist of the ATP-sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(30):12489－12493.

［11］Fan Wen-juan，Li Rui-ling，Deng Jin-bo.Glutamate receptors and neurodegenerative diseases［J］.Journal of Medical Research，2009，38(2):18－24.

［12］Eftinija SD，Jeftinija KV.ATP stimulates release of excitatory amino acids from cultured Schwann cells［J］.Neuroscience，1998，82(3):927－934.