Jungebluth P 著 鄭凱 譚建明 譯

長久以來，人造器官一直是醫(yī)生與患者的共同夢想。2011年7月，瑞典卡羅林斯卡大學(xué)醫(yī)院(Karolinska University Hospital)的胸外科醫(yī)生保羅·麥斯?fàn)柲?Paolo Macchiarini)等團(tuán)隊(duì)完成世界上首例自體干細(xì)胞復(fù)合生物納米人工氣管移植手術(shù)，首次將一個(gè)完全“成長”于實(shí)驗(yàn)室中的人造氣管成功移植入患者體內(nèi)。這是繼2008年該團(tuán)隊(duì)成功完成世界首例組織工程氣管移植后又一重大突破，是全球首例成功的人工培養(yǎng)器官移植手術(shù)，在醫(yī)學(xué)界被認(rèn)為具有里程碑的意義。2011年11月24日《柳葉刀》（The Lancet）雜志在線發(fā)表該項(xiàng)研究成果，現(xiàn)回顧相關(guān)內(nèi)容供同道分享！

瑞典學(xué)者Paolo Macchiarini等團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，對有復(fù)雜氣道缺陷的患者，或可進(jìn)行人造氣管支氣管移植治療。研究對象為1例36歲原發(fā)氣管黏液表皮樣癌患者，曾接受過手術(shù)和放射治療，出現(xiàn)終末端氣管和雙側(cè)主支氣管原位癌復(fù)發(fā)。由于腫瘤范圍較大，已無法手術(shù)切除或原位重建。

研究人員首先借助三維成像技術(shù)，將患者的氣管結(jié)構(gòu)進(jìn)行了三維掃描。倫敦大學(xué)學(xué)院(University College London)納米技術(shù)和再生醫(yī)療學(xué)教授亞歷山大·席法利安(Alexander Seifalian)等團(tuán)隊(duì)以這些圖像為依據(jù)，用納米復(fù)合材料（POSS-PCU）“量身訂做”患者氣管和雙側(cè)主支氣管的主體支架。隨后，這些支架被送往瑞典。提取患者骨髓干細(xì)胞，配制成細(xì)胞懸液后放入“內(nèi)呼吸”(InBreath)生物反應(yīng)器(Harvard Bioscience)中。將納米復(fù)合材料氣管支架浸泡在細(xì)胞溶液中，在生物反應(yīng)器中旋轉(zhuǎn)的時(shí)候保持溫暖無菌狀態(tài)。37℃共同孵育36 h，使骨髓干細(xì)胞黏附到支架上，并且生長發(fā)育成組織。移植手術(shù)術(shù)中再次補(bǔ)種骨髓細(xì)胞和呼吸道內(nèi)膜細(xì)胞。在將腫瘤完全切除后，使用已種有自體骨髓單核細(xì)胞的納米材料生物支架替代已切除的氣道。患者術(shù)后接受粒細(xì)胞集落刺激因子非格司亭(10 μg/kg)和促紅素β(40 000 IU)治療2周。

移植術(shù)后患者恢復(fù)良好，未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥。由于器官來源于患者自身，所以未發(fā)生任何排異反應(yīng)。移植后5個(gè)月，患者無任何癥狀、亦無腫瘤復(fù)發(fā)。人工氣道的生物納米材料與正常氣道組織互相吻合良好。人工氣道覆有血管化的新生黏膜，部分覆蓋有幾近正常的上皮組織。在經(jīng)生物發(fā)生器將單核細(xì)胞種植于支架后，支架逐漸被細(xì)胞外基質(zhì)包被并有CD105+細(xì)胞增殖。外周細(xì)胞的遷移使得間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞表型表達(dá)增加，促紅素受體、抗凋亡基因、miR-34和miR-449等生物標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果連同與再生相關(guān)的血漿因子表達(dá)水平升高表明了干細(xì)胞歸巢和細(xì)胞介導(dǎo)的創(chuàng)面修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑及植入物的新生血管化。

2008年該團(tuán)隊(duì)曾成功完成世界首例組織工程氣管移植，支架采用的是捐獻(xiàn)者氣管的膠原蛋白骨架。而此次采用的支架則完全來自人工創(chuàng)造，選用了新型納米材料為載體。它的成功意味著未來患者不再需要苦苦等待供體，而隨時(shí)可以獲得一個(gè)適合的器官。

流行病學(xué)研究表明：由于診斷的困難，大多數(shù)原發(fā)性惡性氣管腫瘤患者確診時(shí)已不再適合手術(shù)治療(病變超過6 cm或>50﹪總氣管長度)，而被迫采取姑息性治療。這些患者預(yù)后差，5年生存率約為5﹪。此外，由于氣管重建存在困難，即使在可以手術(shù)的患者，完整切除腫瘤的比例也小于60﹪。如果擁有一個(gè)類似于原氣管解剖、生理和生物力學(xué)特性的可替代氣管，這一狀況將大大改善。在2008年，本研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了應(yīng)用組織工程構(gòu)建的氣管移植，采用捐獻(xiàn)者的氣管作為支架，植入從受者骨髓中提取出來的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和呼吸道內(nèi)膜細(xì)胞。然而，這種方法存在局限性，如缺乏適合受者適當(dāng)大小的捐獻(xiàn)器官等。本研究使用了一種定制的人造支架，在體外植入單核細(xì)胞和生長因子誘導(dǎo)的內(nèi)源性干細(xì)胞，并把這一人造氣管移植在1例復(fù)發(fā)的氣管腫瘤患者獲得成功。

患者36歲，診斷為原發(fā)性氣管粘液表皮樣癌，2011年5月住入卡羅林斯卡大學(xué)醫(yī)院（瑞典）。主要癥狀為喘鳴、咳嗽和呼吸困難，曾行腫瘤切除術(shù)和術(shù)后局部放射治療（70 Gy）?，F(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，累及遠(yuǎn)端氣管和雙側(cè)主支氣管?；颊呓邮芰巳鏅z查，包括（18F-FDG）PET掃描，呼吸道黏膜活檢和骨髓活檢。結(jié)果顯示沒有局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)和器官轉(zhuǎn)移。根據(jù)手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤累及范圍已經(jīng)超出手術(shù)切除及原位重建可能，因此為患者推薦進(jìn)行人造氣管移植。患者簽署知情同意書，并得到科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

根據(jù)患者胸部CT和三維的容量數(shù)據(jù)，應(yīng)用納米復(fù)合材料（POSS-PCU）制造氣管支架。首先，根據(jù)患者氣管支氣管的結(jié)構(gòu)、大小和形態(tài)，制造一個(gè)Y形的三維玻璃芯棒。再應(yīng)用POSS-PCU材料制造類似于氣管支氣管軟骨環(huán)組織的U形環(huán)放置在芯棒上。然后將整個(gè)模具放置在POSS-PCU溶液中，凝固后形成一個(gè)固態(tài)多孔的支架。一個(gè)成熟的完全適應(yīng)需求可用于移植的Y形生物人造氣管支架構(gòu)建完成。

采用密度梯度分離法從患者骨髓中收集MNC，并進(jìn)行血白細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞分析；細(xì)胞活力與克隆形成能力檢測；流式細(xì)胞特性檢測和細(xì)菌檢測。細(xì)胞在低糖Dulbecco調(diào)整的Eagle’s合成培養(yǎng)基 (invitrogen, stockholm, sweden)中重懸。將細(xì)胞溶液放入生物反應(yīng)器中，再將支架浸泡在細(xì)胞溶液中，37℃共同孵育36 h，使細(xì)胞種植在人工合成的氣管支架上。

移植前再次收集骨髓，分離提取MNC。術(shù)中再次種植新提取MNC 1次，并加入生長因子：重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β3 (R&D Systems, Minneapolis,MN, USA; 10 μg/cm2)、粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF(Neupogen;Amgen Europe BV, Breda, Netherlands;10 μg/kg)和 重 組 促 紅 細(xì) 胞 生 成 素 β(Roche,Grenzach-Wyhlen, Germany; 40 000 UI)。對移植物切片進(jìn)行檢測，包括掃描電子顯微鏡、熒光和亮視野光學(xué)顯微鏡、共聚焦活細(xì)胞成像檢測，結(jié)果顯示生物納米人工氣管完全滿足于臨床需要。

采用全身麻醉，根據(jù)手術(shù)原則決定氣管切除范圍。因?yàn)樯洗问中g(shù)和放射治療造成疤痕組織形成，心包內(nèi)肺動(dòng)脈須連同腫瘤一同切除，選取人工血管Dacron 8F(Gelsoft, Vascutek, Terumo, Ann Arbor, MI,USA)，連接背主動(dòng)脈和心包外肺動(dòng)脈，阻斷上下腔靜脈26 min。氣管切除范圍包括其遠(yuǎn)端氣管6 cm、整個(gè)右主支氣管和左主支氣管起始處2 cm，冰凍切片顯示所有的切緣腫瘤陰性，完整的切除縱隔淋巴結(jié)。移植入生物納米人工氣管，順序吻合右和左主支氣管，然后吻合近端氣管重建氣道，網(wǎng)膜包裹植入物，逐層關(guān)閉胸腹切口。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，術(shù)后早期如果出現(xiàn)咳嗽反射，粘液清除障礙和胸廓?jiǎng)佣仁芟?，在高于植入物位置行臨時(shí)氣管切開術(shù)。

為促進(jìn)再生過程，患者皮下注射治療藥物G-CSF (10 μg/kg)和重組促紅素 -β(40 000 UI)，移植前1 d給予起始劑量，術(shù)后2周隔天1次。

術(shù)后7 d每天行內(nèi)窺鏡檢查移植物和吻合口。住院期間每周行支氣管鏡檢查，此后每月檢查1次，同時(shí)進(jìn)行人造生物移植物活檢，行HE染色、免疫組織化染色、過碘酸希夫染色和Masson’s染色法檢測。移植后2周隔天測定血清Micro-RNA和血漿可溶性因子 (ELISA)。通過梯度離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，術(shù)前2 d和術(shù)后2周行細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活力檢測、基因表達(dá)分析、染色質(zhì)免疫沉淀分析和PBMC表型流式細(xì)胞儀檢測。

結(jié) 果

移植術(shù)后24 h患者清醒。術(shù)后第2天出現(xiàn)右上葉肺炎，給予廣譜抗生素治療后好轉(zhuǎn)。患者逐步恢復(fù)，并于術(shù)后第5天去除機(jī)械通氣。手術(shù)后1周行支氣管鏡檢查，在內(nèi)鏡接觸的人工氣道內(nèi)層可見出血。臨時(shí)氣管切開插管于18 d后去除。移植后2個(gè)月活檢標(biāo)本顯示：人工氣道大部區(qū)域有新生上皮組織和血管形成，無細(xì)菌或真菌污染。5個(gè)月后呼吸正常，無腫瘤，肺功能較術(shù)前相比明顯改善。

micro-RNA表達(dá)分析結(jié)果：氣道上皮分化的生物標(biāo)志物miR-34和miR-449血清水平在移植后2 d較術(shù)前相比表達(dá)上調(diào)。用于標(biāo)準(zhǔn)化血清miRNA水平的miR-16血清水平?jīng)]有改變。

應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察生物反應(yīng)器中孵育的細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡觀察暴露于生物材料的靜態(tài)活細(xì)胞，支架內(nèi)的細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的形態(tài)，如長的凸起、絲狀或板狀偽足，錨定在支架上。盡管因?yàn)椴牧系亩倘笔寡芯咳藛T無法對細(xì)胞分裂進(jìn)行更為深入的觀察分析，但還是觀察到一些新細(xì)胞分裂，生物反應(yīng)器中細(xì)胞的密集聚合提示細(xì)胞克隆擴(kuò)增。CD105陽性染色證明存在間充質(zhì)細(xì)胞系的亞群。流式細(xì)胞儀表型檢測結(jié)果：生物反應(yīng)器培養(yǎng)介質(zhì)中的MSC和HSC在種植過程后出現(xiàn)選擇性下降，CD90+CD59-細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明它們已很好地附著和種植在支架上。

細(xì)胞計(jì)數(shù)和血漿內(nèi)細(xì)胞因子檢測結(jié)果：外周血流式細(xì)胞儀分析顯示HSC在第6天增加，尤其CD90+細(xì)胞亞群數(shù)量明顯增加。在術(shù)后第2天，循環(huán)MSC數(shù)量升高到同年齡性別健康捐獻(xiàn)者的15倍水平，可能是因?yàn)樾g(shù)前誘導(dǎo)刺激治療的結(jié)果；到第4天和第6天下降到3倍水平；到第10天下降到2.5倍水平。趨化因子SDF-1受體CXCR4的表達(dá)水平在術(shù)后第2天也明顯升高。

干細(xì)胞表型分子分析(染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng))結(jié)果：促進(jìn)性因子H3K4me3在術(shù)后顯示出穩(wěn)定的濃度，而抑制性因子H3K27me3在術(shù)后4 d和6 d出現(xiàn)下降，共同結(jié)果是增加了細(xì)胞分化相關(guān)基因SOX2的總活性，這種效應(yīng)在第10天得到進(jìn)一步增強(qiáng)。另一個(gè)細(xì)胞分化相關(guān)基因GNL3也顯示出相同結(jié)果。這些染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達(dá)的結(jié)果與流式細(xì)胞分析結(jié)果相一致。

JAK/STAT途徑是被重組促紅素beta激活的一個(gè)主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，檢測PBMC中JAK/ STAT途徑基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在術(shù)后4 d顯示為逐步下降，隨后在第6、10天逐步恢復(fù)。PBMCs抗凋亡基因分析顯示BCL2L1和EPOR在第6天出現(xiàn)表達(dá)峰值。

討 論

本個(gè)案研究結(jié)果顯示了自體干細(xì)胞復(fù)合生物納米人工氣管移植的可行性。盡管組織工程器官和復(fù)雜組織的臨床移植取得很大的進(jìn)展，但尚無一種安全、合適的氣管替代臨床解決方案。本研究利用生物反應(yīng)器系統(tǒng)，將MSC體外擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化為自體軟骨細(xì)胞和自體上皮細(xì)胞，構(gòu)建完全人工的組織工程氣管，并首次將其應(yīng)用于臨床移植獲得成功。本研究團(tuán)隊(duì)曾應(yīng)用人捐獻(xiàn)的去細(xì)胞氣管作為支架，通過在移植物內(nèi)種植自體細(xì)胞(骨髓MSC和呼吸道細(xì)胞)，并應(yīng)用轉(zhuǎn)化因子和組織保護(hù)因子進(jìn)行培養(yǎng)，隨后用于良性或惡性的呼吸道疾病患者獲得成功。然而，這種方法有一定的局限性。例如：需要長時(shí)間的去細(xì)胞過程(15～20 d)；需要適合患者大小的捐獻(xiàn)氣管；自然基質(zhì)成分改變的風(fēng)險(xiǎn)；移植物在體外細(xì)菌污染以及最重要的是要求獲得一個(gè)捐贈(zèng)器官。

患者的原發(fā)性腫瘤侵及支氣管分叉和遠(yuǎn)端氣管5 cm，是手術(shù)切除的絕對禁忌癥。患者盡管接受了70 Gy的放射治療，仍然出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)并伴有嚴(yán)重喘鳴，而等待捐獻(xiàn)時(shí)間是不可預(yù)測的，所以本研究決定嘗試一種新的治療方法，既應(yīng)用基于POSSPCU納米復(fù)合材料完全人工的氣道來置換手術(shù)切除的氣道部分。這一方案基于以下事實(shí)：POSSPCU具有生物相容性、無毒、不可降解、惰性、可以忽略不計(jì)的免疫反應(yīng)性等特點(diǎn)；另外，它具有機(jī)械屬性、體內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性、納米結(jié)構(gòu)等特性，決定了POSS-PCU是生物工程氣管移植的理想材料。

以前曾嘗試過的各種合成材料一直未獲得成功，原因包括：細(xì)胞種植失敗、感染、移動(dòng)、狹窄和壞死等。這些缺陷導(dǎo)致氣管并不位于間質(zhì)環(huán)境中，而是直接接觸呼吸道空氣，使感染和污染更容易發(fā)生。因此本研究利用一個(gè)生物反應(yīng)器環(huán)境，使自體單核細(xì)胞植入生物人工支架。結(jié)果表明，在生物反應(yīng)器內(nèi)36 h的動(dòng)態(tài)孵育足以使單核細(xì)胞附著于生物材料。經(jīng)過2 d種植后，暴露在生物反應(yīng)器中的細(xì)胞形成密集細(xì)胞團(tuán)，而靜態(tài)孵化的細(xì)胞表現(xiàn)為均勻分布，表明生物反應(yīng)器可能幫助巢狀細(xì)胞團(tuán)增殖?？贵w標(biāo)記和形態(tài)分析顯示移植物內(nèi)存在間充質(zhì)細(xì)胞表型CD105+的細(xì)胞增殖，而非造血細(xì)胞表型。盡管在經(jīng)過生物反應(yīng)器中細(xì)胞種植后的支架上可以觀察到一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)樣結(jié)構(gòu)，但這一結(jié)構(gòu)是來源于自體血清還是種植細(xì)胞尚不清楚。

最常見的肺移植后氣道并發(fā)癥是壞死、裂開、狹窄、可能與移植相關(guān)的局部缺血。在本研究中，一個(gè)無血管的Y形納米復(fù)合材料被植入患者體內(nèi)，最初并發(fā)真菌感染在移植4個(gè)月之內(nèi)治愈；隨后腔內(nèi)表面部分覆蓋呼吸道黏膜，幾近健康的上皮組織和內(nèi)皮增生。這些證據(jù)表明，一個(gè)生物工程合成的納米復(fù)合材料氣管支氣管可以在體內(nèi)細(xì)胞化，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榛畹木哂泄δ艿慕Y(jié)構(gòu)，與鄰近組織完全結(jié)合在一起。氣道上皮分化生物標(biāo)志物miR-34/449檢測結(jié)果顯示患者術(shù)后存在氣道上皮的分化過程。

合成物移植需要解決的關(guān)鍵問題之一是在移植后招募修復(fù)細(xì)胞，促進(jìn)新移植材料的整合和重塑。有助于再生的細(xì)胞成分可以來源于局部組織或循環(huán)祖細(xì)胞。本研究觀察到HSC動(dòng)員和循環(huán)MSC數(shù)量增加，這與先前報(bào)道的G-CSF作為唯一動(dòng)員藥物不會(huì)動(dòng)員MSC的結(jié)果有所不同。事實(shí)上，在植入部位手術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子和毒素釋放可能是MSC動(dòng)員的原因。研究發(fā)現(xiàn)大量與傷口愈合相關(guān)水溶性介質(zhì)的釋放，這可能促進(jìn)MSC動(dòng)員，正如先前其他研究人員報(bào)道的結(jié)果。另外，G-CSF可以誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞擴(kuò)增和蛋白酶釋放，可以促進(jìn)祖細(xì)胞動(dòng)員。植入物誘導(dǎo)局部產(chǎn)生的血液活化物質(zhì)，如C3a和凝血酶，可以增強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞的活化、募集、組織修復(fù)和和局部的免疫抑制。研究還發(fā)現(xiàn)強(qiáng)大的生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的系統(tǒng)性釋放，可能是募集的祖細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞釋放產(chǎn)生。此外，研究人員記錄到重組促紅素受體早期表達(dá)增加，及BCL2L1等抗凋亡基因表達(dá)上調(diào)。在炎癥反應(yīng)過程中，創(chuàng)傷相關(guān)細(xì)胞因子被釋放，促進(jìn)促紅素受體表達(dá)，并通過降低局部促紅素與促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制組織保護(hù)作用。為了避免這種術(shù)后早期局部促紅素的缺乏，給予補(bǔ)充重組促紅素(500 UI/kg)，目的是促進(jìn)和觸發(fā)早期局部組織的保護(hù)作用和再生。

綜上所述，以上結(jié)果證明了首次生物工程人工支氣管臨床移植的成功完成，也為這種方法的可行性提供了進(jìn)一步的證明。

評論：《柳葉刀》雜志在近3年內(nèi)刊登了3篇關(guān)于組織工程器官替代人體組織器官臨床應(yīng)用獲得良好療效的文章。上述瑞典研究團(tuán)隊(duì)先后應(yīng)用捐獻(xiàn)者人體氣管以及新型納米支架材料為載體復(fù)合受者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成功修復(fù)了氣管腫瘤切除后的氣道。另一研究團(tuán)隊(duì)則成功地將組織工程血管用于血液透析過程。上述研究從臨床的角度證明了利用體外人工的方法模擬體內(nèi)器官的生物學(xué)特性和解剖結(jié)構(gòu)，進(jìn)而替換各種原因?qū)е聫U用器官的可行性。

目前國內(nèi)外均有關(guān)于組織工程皮膚以及軟骨用于臨床的報(bào)告。然而，需要清醒地認(rèn)識到，氣管及血管屬于相對較簡單的腔道組織，對其構(gòu)建只不過是組織工程器官替代計(jì)劃跨出的一小步。要成功構(gòu)建更加復(fù)雜的人工臟器(如肝臟、腎臟和心臟等實(shí)體器官)，并讓其發(fā)揮與體內(nèi)正常器官同等的功效，還有眾多科學(xué)“難關(guān)”須要逾越。

人造器官的宏偉規(guī)劃描繪了一幅美好的愿景，如同所有人類科學(xué)的進(jìn)步，只要秉著堅(jiān)定的信心不懈努力，相信在不久的將來，適合每個(gè)個(gè)體的人造器官可在“人造器官銀行”中任意提取。人造氣管、血管的成功構(gòu)建及臨床應(yīng)用已經(jīng)敲開了人造器官時(shí)代到來的大門。

(本文編譯自：Jungebluth P, Alici E, Baiguera S, et al. Tracheobronchial transplantation with a stemcell-seeded bioartificial nanocomposite: a proofof-concept study[J]. Lancet, 2011, 378(9808):1997–2004.）