倪開(kāi)元 徐鯤杰 洪曉明 汪東杰

腹腔鏡胃癌根治術(shù)患者外周血CK19mRNA的變化及意義

倪開(kāi)元 徐鯤杰 洪曉明 汪東杰

目的 探討腹腔鏡胃癌根治術(shù)患者外周血CK19mRNA的變化及意義。 方法 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）技術(shù)檢測(cè)CK19mRNA在腹腔鏡組（14例）及開(kāi)腹組（37例）胃癌根治術(shù)外周血的表達(dá)情況。結(jié)果 兩組間僅手術(shù)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），術(shù)中失血量及清除淋巴結(jié)數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。腹腔鏡組患者手術(shù)前后CK19mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。開(kāi)腹組患者手術(shù)前后CK19mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。開(kāi)腹組術(shù)后CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者明顯多于腹腔鏡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 與開(kāi)腹手術(shù)相比，腹腔鏡胃癌根治術(shù)可以降低靜脈血CK19mRNA的陽(yáng)性率，減少術(shù)后腫瘤血循微轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。

腹腔鏡 胃癌 微轉(zhuǎn)移 細(xì)胞角蛋白19 mRNA

目前，盡管腹腔鏡胃癌根治術(shù)技術(shù)日趨成熟，在胃癌高發(fā)的亞洲地區(qū)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但其對(duì)患者術(shù)后血循環(huán)微轉(zhuǎn)移的影響仍不完全確定，尚存在爭(zhēng)議。本研究采用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)腹腔鏡胃癌根治術(shù)患者手術(shù)前后外周血細(xì)胞角蛋白19（CK19）的表達(dá)情況，旨在探討腹腔鏡胃癌根治術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞血循環(huán)微轉(zhuǎn)移的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009-06—2011-03收治的胃癌患者51例，術(shù)前均常規(guī)行電子胃鏡活檢或超聲胃鏡檢查，明確病變部位及病理類型，病理檢查確診為胃癌。術(shù)前常規(guī)行胸片、心電圖、腹部超聲及全腹部CT平掃+增強(qiáng)檢查，無(wú)肝臟及其他部位轉(zhuǎn)移征象。排除TNM分期Ⅳ患者。其中采用腹腔鏡胃癌根治術(shù)治療14例（腹腔鏡組），男11例，女3例；年齡37～68（58±11）歲；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期7例；腫瘤部位：胃上1/3者3例，胃中1/3者1例，胃下1/3者10例。采用開(kāi)腹手術(shù)治療37例（開(kāi)腹組），男31例，女6例；年齡49～77（63±12）歲；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期11例，Ⅲ期19例；腫瘤部位：胃上1/3者3例，胃中1/3者1例，胃下1/3者10例。兩組患者性別、年齡、TNM分期及腫瘤部位的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 兩組患者均遵循無(wú)瘤原則進(jìn)行手術(shù)，嚴(yán)格按照腫瘤根治原則進(jìn)行手術(shù)操作，淋巴廓清均為D2程度。兩組手術(shù)均由同一組醫(yī)師實(shí)施。

1.2.2 標(biāo)本處理 兩組患者均于手術(shù)當(dāng)天術(shù)前行頸內(nèi)靜脈深靜脈置管，在全麻達(dá)成后不同時(shí)段[手術(shù)開(kāi)始前、氣腹撤除后（腔鏡組）、關(guān)腹后（開(kāi)腹組）]進(jìn)行采血。棄去注射器抽取的前5ml血液，以減少標(biāo)本污染，再抽取5ml血液加入消毒肝素抗凝冷凍管，術(shù)后標(biāo)本2 000r/min離心10min，立即放入-80℃低溫冰箱凍存，而后統(tǒng)一檢測(cè)（標(biāo)本采集后2d內(nèi)完成）。

1.2.3 FQ-PCR檢測(cè)

1.2.3.1 外周血單核細(xì)胞的提取 取出血液標(biāo)本，于電熱恒溫水槽快速解凍。將5ml抗凝外周血加入等體積0.9%氯化鈉注射液稀釋，取10ml離心管，先加入2ml淋巴細(xì)胞分離液，再取稀釋好的標(biāo)本5ml沿管壁緩慢加入，4℃靜置5min后，2 000 r/min離心10min，吸取白細(xì)胞層（勿吸取底部紅細(xì)胞層）于1.5ml離心管中，12 000r/ min離心5min，棄上清液，沉淀加入1ml0.9%氯化鈉注射液輕輕吹打均勻，12 000r/min離心5min，棄上清液，留取沉淀備用。

1.2.3.2 細(xì)胞總RNA提取 沉淀加入1ml RNA提取液（Trizol），充分混勻。室溫靜置5min，加入0.2ml氯仿，封蓋后用力振搖 15s，4℃靜置 5min，而后 4℃下 12 000r/min離心10min，離心后反應(yīng)管分3層，底層為氯仿層，中間層及無(wú)色水相上層，水相上層的體積一般為提取液體積的60%。將上層水相轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中，加等體積異丙醇輕輕混勻4℃靜置10min，然后4℃下12 000r/min離心15min（離心前通常未見(jiàn)RNA沉淀，離心后可見(jiàn)膠狀沉淀）。棄上清液，加入1ml75%的乙醇(注：75%乙醇配制時(shí)須用DEPC H2O）洗滌RNA沉淀，4℃下7 500 r/min離心5min，小心吸去大部分乙醇。將沉淀在室溫空氣中干燥10min。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取滅菌0.2ml離心管配備逆轉(zhuǎn)錄體系，Oligo（dT）18Primer 1μl、DEPC-treatedWater 6μl、提取的RNA 5μl，70℃下5min后立刻置于冰上1min。緊接上一步，5×Reaction Buffer 4μl、RiboLock RNase Inhibitor 1μl、10mmol/LdNTP mix 2μl，37℃下5min后立刻置于冰上1min。立即取RevertAidTMM-MuLVRT 1μl，于42℃下60min、70℃下10min后-80℃保存。

1.2.3.4 試劑配制 從試劑盒中取出CK19反應(yīng)液，在室溫下融化并振蕩混勻后，2 000r/min離心10s。計(jì)算需準(zhǔn)備反應(yīng)數(shù)n[n=樣本數(shù)+1（陰性對(duì)照）+1（陽(yáng)性對(duì)照）+4（定量標(biāo)準(zhǔn)品）]。測(cè)試反應(yīng)體系配制方法：CK19反應(yīng)液44μl，Taq酶1μl。計(jì)算上述各試劑的使用量，加入離心管中，充分混勻后，按45μl量分別分裝到不同的PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)管中分別加入5μl的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA及定量標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品需倍比稀釋成107、106、105、104），瞬時(shí)離心準(zhǔn)備上機(jī)。

1.2.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析 將各反應(yīng)管按一定順序放入PCR儀上，按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性93℃30min，然后93℃45s、55℃60s共40個(gè)循環(huán)。選擇在第二步第二階段采集FAM熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。調(diào)節(jié)baseline cycle至2～15，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品的最高點(diǎn)，最后到Reporter窗口下記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的值。檢測(cè)樣本Ct≤37.0者判為陽(yáng)性，Ct＞37.0者重測(cè)，重測(cè)結(jié)果Ct值＜40者為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)情況的比較 腹腔鏡組手術(shù)時(shí)間255～345（280±73）min，術(shù)中失血量60～200（100± 30）ml，清除淋巴結(jié)11～24（12±3.5）枚；開(kāi)腹組手術(shù)時(shí)間150～255（160±58）min，術(shù)中失血量100～400（110±40）ml，清除淋巴結(jié)11～29（13±2.5）枚。兩組間僅手術(shù)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），術(shù)中失血量及清除淋巴結(jié)數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。2.2 兩組患者手術(shù)前后外周血CK19mRNA的表達(dá)情況 腹腔鏡組患者術(shù)前外周血CK19mRNA陽(yáng)性5例（35.71%），陰性9例；術(shù)后陽(yáng)性6例（42.86%），陰性8例（57.14%）；手術(shù)前后CK19mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。開(kāi)腹組患者術(shù)前外周血CK19mRNA陽(yáng)性13例（35.14%），陰性24例；術(shù)后陽(yáng)性25例（67.6%），陰性12例（32.4%）；手術(shù)前后CK19mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。開(kāi)腹組術(shù)后CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者明顯多于腹腔鏡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

微轉(zhuǎn)移通常是指非血液系統(tǒng)的惡性腫瘤在發(fā)展過(guò)程中，擴(kuò)散并存活于血循環(huán)、骨髓、淋巴系統(tǒng)、肝及肺等組織器官中的微小腫瘤細(xì)胞灶，能夠逃避免疫監(jiān)視、侵犯血管和發(fā)展成為肉眼可見(jiàn)的病變。一般情況下，常規(guī)檢查方法如B超、增強(qiáng)CT掃描、核磁共振成像、單克隆抗體放射免疫顯影技術(shù)、普通病理檢查都很難發(fā)現(xiàn)。目前認(rèn)為，臨床轉(zhuǎn)移是由微轉(zhuǎn)移發(fā)展而來(lái)，但腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管和血管后并不意味著一定都會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，最終僅有少數(shù)微轉(zhuǎn)移能發(fā)展為臨床轉(zhuǎn)移。

CK19是Ⅰ型細(xì)胞骨架中中間纖維的一種，具有嚴(yán)格的組織特異性。其局限表達(dá)于胃腸上皮細(xì)胞，在所有的胃癌組織中幾乎都明顯表達(dá)，且在侵襲、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散到其他組織器官時(shí)始終保持穩(wěn)定[1-2]。Fujita等[3]的研究顯示，較之CK18、CK20和CEA，CK19是檢測(cè)胃癌血循環(huán)微轉(zhuǎn)移的更好的標(biāo)志物。檢測(cè)胃癌患者外周血液微轉(zhuǎn)移CK19可提高胃癌臨床分期的準(zhǔn)確性，幫助綜合判斷患者的預(yù)后，且可能有助于早期診斷胃癌遠(yuǎn)處臟器微小轉(zhuǎn)移，指導(dǎo)術(shù)后輔助治療的選擇[4]。

目前，盡管FQ-PCR方法具有較高的敏感性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢出率較高，但采用FQ-PCR方法或其他方法檢測(cè)出的血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移灶對(duì)判斷癌癥患者的預(yù)后有無(wú)影響尚無(wú)定論，因?yàn)榘┘?xì)胞在血液循環(huán)中的播散并不等于一定會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌，無(wú)臨床轉(zhuǎn)移癌也不等于無(wú)癌細(xì)胞播散。胃癌細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移灶若存在于血液循環(huán)中，仍舊增加了胃癌復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性，其也是形成臨床遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的先決條件，因此可以通過(guò)監(jiān)測(cè)外周血中的CK19mRNA來(lái)觀察胃癌患者血循環(huán)微轉(zhuǎn)移的變化。

有研究表明，CK19mRNA在胃癌外周血中的陽(yáng)性表達(dá)率為38.4%～77.35%[5-7]。而本研究結(jié)果顯示，胃癌患者術(shù)前外周血中CK19mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為31.37%，低于文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑以及入選病例不同有關(guān)。腹腔鏡組患者手術(shù)前后外周血CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯變化，而開(kāi)腹組術(shù)后外周血CK19mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯上升，提示腹腔鏡手術(shù)并未顯著增加血液CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)率，較之開(kāi)腹手術(shù)可以降低靜脈血CK19mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率，減少術(shù)后腫瘤血循微轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。筆者認(rèn)為，腹腔鏡手術(shù)在操作中通過(guò)影像系統(tǒng)使術(shù)野有一定的放大效應(yīng)，可以使解剖更精細(xì)，術(shù)中用抓鉗對(duì)少量組織抓持進(jìn)行暴露，游離過(guò)程中對(duì)腫瘤的機(jī)械性刺激小，超聲刀的使用在切斷管道的同時(shí)使其斷端閉合，減少了癌細(xì)胞播散的機(jī)會(huì)，有助于減少腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散?，F(xiàn)階段，腹腔鏡胃癌根治術(shù)仍處于探索階段，本研究初步證實(shí)腹腔鏡手術(shù)能夠減少腫瘤細(xì)胞在血循環(huán)中的微轉(zhuǎn)移，但臨床遠(yuǎn)期療效及其對(duì)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響還有待長(zhǎng)期隨訪和多中心臨床試驗(yàn)及循證醫(yī)學(xué)證實(shí)。

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Expression of CK19 mRNA in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection and its clinical significance

Gastric cancerMicrometastasis Laparoscopy CK19 mRNA

2012-08-14）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

315100 寧波市鄞州第二醫(yī)院普外科

【 Abstract】Objective To investigate the expression of CK19 mRNA in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection and its significance. Methods The expression of peripheral blood CK19mRNA was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)technology in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection(laparoscopy group,n=14)or laparotomy resection(laparotomy group,n=37).Results The operation time in laparoscopy group was shorter than that in laparotomy group(P＜0.01),while there were no significant differences in e intraoperative blood loss and number of removed lymph node between two groups(P＞0.05).There was no difference in expression of CK19mRNA before and after operation in laparoscopy group(P＞0.05),while there was statistically significant in laparotomy group (P＜0.05).The rate of positive CK19mRNA expression in laparotomy group after operation was higher than that in laparoscopic group(P＜0.05). Conclusion Compared to laparotomy,laparoscopic radical resection of gastric cancer can reduce the positive rate of CK19mRNA expression in peripheral blood and the risk of tumor micrometastasis after operation.