王宇翀 綜述 薛春雨 審校

組織工程的目的是構建具有正常生理功能的組織和器官，用于修復人體的疾病和缺損[1]，目前已經取得了一定的突破[2]。體外構建的組織工程化產品中，已有皮膚[3]、軟骨和骨[4]應用于臨床。但是，體外構建的組織工程化組織缺乏與之相適應的血液供應系統[5]，是目前組織工程面臨的難點。

現在，組織工程血管化主要有兩類策略。第一類是基于內皮細胞等構建新的血管，在這個過程中生長因子也有促進新生血管的作用。第二類是基于支架技術，包括天然生物衍生的支架和人工合成支架。以上兩種策略沒有明顯界限，而是相互重疊。

1 人體內的新生血管形成過程

人體內新生血管形成基于兩種過程：血管生成（Angiogenesis）與血管形成（Vasculogenesis）。血管生成是原先存在的血管以出芽的方式生成新的毛細血管。血管形成是內皮細胞重組后形成毛細血管，并與原有血管網對接的過程。最初，內皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）分化為成熟的內皮細胞，這些細胞在無血管的區(qū)域增殖并且創(chuàng)造了第一個初始的血管網絡[6]。然后，新的毛細血管從原先存在的血管生出，內皮細胞釋放基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）降解細胞外基質，細胞遷移到新的間隙，出芽形成新的血管。這個過程由多種類型的細胞、黏附蛋白、生長因子、連接分子、內源性抑制劑等共同參與和相互作用而產生[7]。

形成所需生理功能的血管不僅需要時間順序上的精確調節(jié)，也需要在血管成熟后抑制內皮細胞的過度生長，從而抑制過多的營養(yǎng)和氧氣供應到組織。相反，血管延遲成熟會抑制血液循環(huán)或導致血管退化，甚至造成血管穿孔、缺失[8]。

對于缺血組織再灌注或誘導組織工程血管產生，上述過程是必不可少的。事實證明，缺血組織新血管生成恢復再灌注已經實現，然而組織工程產物血管化問題尚未解決。

2 組織工程誘導血管生成的策略

2.1 基于內皮細胞等構建血管

機體內所有的血管內壁都是由內皮細胞組成的，大的血管外層有平滑肌細胞包裹，而毛細血管主要是由血管內皮細胞組成。血管內皮細胞的作用主要有抗凝、選擇透過性、調劑血壓和血管生成的作用[9]。

支架上的細胞得以成活，需要通過擴散或灌注得到足夠的營養(yǎng)和氧氣。然而，毛細管擴散的最大距離在100～200 μm[10]。研究表明，只有皮膚、軟骨和骨組織可以接受更遠的血管通過擴散所提供的氧氣和營養(yǎng)，所以目前只有組織工程皮膚、軟骨和骨應用于臨床。因此，體外較厚組織的血管化構建和體內血管的連接，是組織工程化組織構建成功的必要條件之一。

在體外，通常把內皮細胞、成纖維細胞等單獨或混合接種于支架，以構建三維血管化的結構。隨后將構建的血管網絡植入缺血區(qū)，建立一個由周圍血管提供血液的組織，這一過程稱為吻合[11]。體外預血管化的優(yōu)點是宿主血管不需要長入工程化組織中間，而可以吻合邊緣的血管結構。缺點是灌注慢于體內的血管化。許多研究已證明，宿主細胞能夠在適當的人工結構中建立一個可灌注的血管網絡[12]，經過成功的血管化后，可以取出并用于插入缺血性靶位點。這一方法的缺點是需要至少三次手術：植入無細胞支架、取出血管化支架和植入缺血區(qū)[13]。

2.2 生長因子及細胞因子促進血管化

生長因子及細胞因子對血管化過程具有重要的促進作用，可有效刺激內皮細胞和祖細胞的聚集與增殖，促進新生血管形成及發(fā)育成熟。目前已知的促進血管生成的因子主要有 VEGF、bFGF、HGF 等；另外一些細胞因子，如 PDGF、TGF-β、Ang等，作為間接的血管生成因素參與內皮細胞的再生，加速血管化的進程。

為使生長因子效能最大化，往往需先解決一些問題。例如，血管生成因子在體內具有高度不穩(wěn)定性，因此多采用局部注射和控釋等手段[14]。為了克服生長因子的高降解率，找到可隨時間變化釋放生長因子至目標植入部位的生物材料，確保生長因子的有效傳遞和持續(xù)發(fā)揮作用，目前合成了各種復合材料的緩釋裝置[15]?？山到舛嗫讓咏Y構或預包埋的微球生物材料已用于控制生長因子的釋放，把生長因子包埋在生物可降解的聚合物中，如聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）或多聚賴氨酸（PLL）[16]，這樣生長因子可以持續(xù)釋放。離子白蛋白微球技術則可以同時控制兩種生長因子釋放。

另一種方法是使用轉染的細胞過度表達生長因子。一旦種子細胞種植在支架上，這些細胞就可以持續(xù)釋放生長因子。Geiger等[17]將涂有VEGF質粒DNA的BMSCs支架和接種轉染VEGF質粒DNA的BMSCs支架進行比較，結果發(fā)現兩組的血管生成和骨生成都顯著增強，其中后者的血管再生更快，骨支架吸收的速度也更快。同樣，心肌梗死后使用VEGF基因轉染MSCs可促進心肌血管的生成，改善心肌的灌注。

生長因子的劑量和組合方式也是血管生成與否的關鍵因素。例如，高水平的PDGF會導致血管的不穩(wěn)定[18]；通過Ang-1過度表達，來加強三維多孔藻酸鹽支架的血管化，可能會導致血管內皮增生和血管丟失減少[19]。目前，大部分實驗的重點仍然是研究一種類型的生長因子，而生長因子之間和多信號通路之間復雜的相互作用也應考慮。在新構建的水凝膠基質上，通過結合VEGF和Ang-1，或結合VEGF、IGF、SDF-1的組合，均取得良好效果[20]。

為了避免生長因子在靶點以外的部位產生不良影響，許多研究也致力于生長因子作用部位的固定[21]。Saik等[22]通過共價固定PDGF-BB在聚乙二醇水凝膠中來促進血管生成。除此之外，特定的黏附肽或細胞外基質分子修飾生物材料也可用來促進血管生成。

2.3 血管化支架

組織工程中血管化和支架材料的特性有很大的關系。除了在儲存和釋放功能性化合物和為所有參與其中的細胞提供合適的表面類型外，支架本身就能夠促進血管的形成。人工構建細胞外基質的三維支架結構，不但為內皮細胞等的生長提供了一個有利的空間，也為植入的細胞分泌細胞外基質并最終形成相應的組織或器官提供了一個良好的環(huán)境。血管化支架可分為天然生物衍生的血管支架和人工合成的血管支架兩大類。

2.3.1 天然生物衍生的血管支架

目前在體外模仿天然血管結構和重建微血管網絡仍具有很大的挑戰(zhàn)性，生物結構的重新利用可能是解決該問題的方法[23]。通過部分脫細胞基質可以得到一個自然衍生的三維微血管網絡，脫細胞基質的制作過程揭示了動脈和靜脈穿過膠原蛋白和彈性蛋白纖維基質的特點[24]。血管化的生物基質用于組織工程可提供適當的營養(yǎng)，確保了更好的移植效果[25]。天然生物衍生的血管支架的優(yōu)點是：①材料的生物相容性較好；②可降解性好，且降解產物無毒副作用；③材料本身具有相同或類似的細胞外基質結構，可促進細胞黏附、增殖和分化。其缺點是：①制作過程難以規(guī)范化；②無法復制出完全相同的支架；③取材在倫理上仍有爭議。

2.3.2 人工合成的血管支架

人工合成的血管支架從簡單的支撐作用，到目前已擴展為可以提供機械穩(wěn)定性、愈合能力與降解率相適應的綜合性支架[26]。對于支架材料的選擇要考慮到支架硬度、表面形態(tài)、結構特性、生物相容性、孔隙率（包括孔徑和孔間距離）和降解特性等[27]。此外，巧妙的三維設計和高分辨率制造技術也可用來精確控制細胞排列和血管生成[28]。但是，目前尚未發(fā)現一種能同時滿足上述條件的人工支架。人工合成的血管支架的優(yōu)點是：①可選擇多樣的材料與先進的制造技術；②可以大批量標準化生產；③根據實際需要可進行多樣化設計。其缺點是：①空間結構復雜的幾何形狀制作難度大；②缺乏必要的生物功能；③細胞黏附力差。

3 存在的問題與展望

組織工程顯示出誘人的前景和巨大的可能，而組織工程血管化仍然是組織工程中的關鍵問題。既往的研究發(fā)現了許多促進血管化的方法，有了一些新的見解和進展，但同樣存在許多亟待解決的問題，比如進一步闡釋血管化的具體機制、合理高效利用生長因子、發(fā)現新的支架材料，以及各種因子與材料潛在的風險等。應將不同的方法、技術和學科結合在一起，研究更加高效簡便的組織工程血管化方法，為構建組織工程化組織并應用于臨床奠定基礎。

[1] Kannan RY,Salacinski HJ,Sales K,et al.The roles of tissue engineering and vascularisation in the development of microvascular networks:a review[J].Biomaterials,2005,26(2):1857-1875.

[2] Novosel EC,Kleinhans C,Kluger PJ,et al.Vascularization is the key challenge in tissue engineering[J].Adv Drug Deliver Rev,2011,63(3):300-311.

[3] Shevchenko RV,James SL,James SE,et al.A review of tissueengineered skin bioconstructs available for skin reconstruction[J].J R Soc,2010,7(2):229-258.

[4] Ruano-Ravina A,Jato Díaz M,Seiber K,et al.Autologous chondrocyte implantation:a systematic review[J].Osteoarthritis Cartilage,2006,14(3):47-51.

[5] Phelps EA,Garcia AJ,Ruvinov E,et al.Engineering more than a cell:vascularization strategies in tissue engineering[J].Curr Opin Biotechnol,2010,20(4):704-709.

[6] Melero-Martin JM,De Obaldia ME,Kang SY,et al.Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells[J].Circ Res,2008,103(2):194-202.

[7] Laschke MW,Harder Y,Amon M,et al.Angiogenesis in tissue engineering:breathing life into constructed tissue substitutes[J].Tissue Eng,2006,12(1):2093-2104.

[8] Moon JJ,Saik JE,Poche RA,et al.Biomimetic hydrogels with proangiogenic properties[J].Biomaterials,2010,31(3):3840-3847.

[9] Kandárová H,Liebsch M,Spielmann H,et al.Assessment of the human epidermismodel SkinEthic RHE for in vitro skin corrosion testing of chemicals according to new OECD TG[J].Toxicol In Vitro,2006,20(5):547-559.

[10] Rouwkema J,Rivron NC,van Blitterswijk CA,et al.Vascularization in tissue engineering[J].Trends Biotechnol,2008,26(7):434-441.

[11] Rivron NC,Liu JJ,Rouwkema J,et al.Engineering vascularised tissues in vitro[J].Eur Cells Mater,2008,15(3):27-40.

[12] Chen X,Aledia AS,Ghajar CM,et al.Prevascularization of a fibrin-based tissue constructacceleratesthe formation of functional anastomosis with host vasculature[J].Tissue Eng,2009,15(2):1363-1371.

[13] Gerlach JC,Johnen C,Ottoman C,et al.Method for autologous single skin cell isolation for regenerative cell spray transplantation with non-cultured cells[J].Int J Artif Organs,2011,34(3):271-279.

[14] Leslie-Barbick JE,Moon JJ,West JL,et al.Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol)diacrylate hydrogels[J].J Biomater Sci Polym Ed,2009,20(1):1763-1779.

[15] Borselli C,Ungaro F,Oliviero O,et al.Bioactivation of collagen matrices through sustained VEGF release from PLGA microspheres[J].J Biomed Mater Res,2010,92(4):94-102.

[16] Karal-Yilmaz O,Serhatli M,Baysal K,et al.Preparation and in vitro characterization ofvascularendothelialgrowth factor(VEGF)-loaded poly(D,Llactic-co-glycolic acid)microspheres using a double emulsion/solvent evaporation technique[J].J Microencapsul,2011,28(3):46-54.

[17] Yang J,Zhou W,Zheng W,et al.Effects of myocardial transplantation of marrow mesenchymal stem cells transfected with vascular endothelial growth factor for the improvement of heart function and angiogenesis after myocardial infarction[J].Cardiology,2007,107(4):17-29.

[18] Andrae J,Gallini R,Betsholtz C,et al.Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J].Genes Dev,2008,22(3):1276-1312.

[19] Kraehenbuehl TP,Ferreira LS,Zammaretti P,et al.Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells[J].Biomaterials,2009,30(5):4318-4324.

[20] Sun G,Shen YI,Kusuma S,et al.Functional neovascularization of biodegradable dextran hydrogels with multiple angiogenic growth factors[J].Biomaterials,2011,1(2):133-143.

[21] Yao C,Markowicz M,Pallua N,et al.The effect of cross-linking of collagen matrices on their angiogenic capability[J].Biomaterials,2008,29(3):66-74.

[22] Saik JE,Gould DJ,Watkins EM,et al.Covalently immobilized platelet-derived growth factor-BB promotes angiogenesis in biomimetic poly(ethylene glycol)hydrogels[J].Acta biomaterialia,2011,8(1):10-17.

[23] Kelm JM,Lorber V,Snedeker JG,et al.A novel concept for scaffoldfree vessel tissue engineering:selfassembly of microtissue building blocks[J].J Biotechnol,2010,148(1):46-55.

[24] Moldovan L,Craciunescu O,Oprita EI,et al.Collagenchondroitin sulphate -hydroxyapatite porous composites:preparation,characterization and in vitro biocompatibility testing[J].Rom Biotech Lett,2009,14(3):4459-4466.

[25] Boehnke K,Mirancea N,Pavesio A,et al.Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents[J].Eur J Cell Biol,2007,86(3):731-746.

[26] Stevens KR,Pabon L,Muskheli V,et al.Scaffold-free human cardiac tissue patch created from embryonic stem cells[J].Tissue Eng,2009,15(1):1211-1222.

[27] Sasagawa T,Shimizu T,Sekiya S,et al.Design of prevascularized three-dimensional cell-dense tissues using a cell sheet stacking manipulation technology[J].Biomaterials,2010,31(3):1646-1654.

[28] Xie Y,Rizzi SC,Dawson R,et al.Development of a threedimensional human skin equivalent wound model for investigating novel wound healing therapies[J].Tissue Eng C Meth,2010,16(4):1111-1123.