朱震 沈振亞 陳海軍

[摘要] 目的 大鼠胸腺以豚鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行修飾，然后行豚鼠到大鼠的異種心臟移植。研究以間充質(zhì)干細(xì)胞修飾胸腺對異種移植心臟存活時間的影響。 方法 供體豚鼠和受體SD大鼠各20只隨機分成四組，A組（對照組）；B組（胸腺修飾IT組）；C組（CVF組）；D組（IT加CVF組）。觀測指標(biāo)：移植心臟存活時間，病理變化，供受體異種淋巴細(xì)胞毒性試驗。 結(jié)果 供心平均存活時間：A組（23.20±6.14）min，B組（24.20±9.28）min，C組（335.40±49.23）min，D組（451.00±50.10）min。A與B組兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。C、D組平均存活時間較A、B明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。D組與C組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。供受體淋巴細(xì)胞反應(yīng)，測得光密度值分別為：D組為（381.20±12.01），A組為（590.20±15.38），胸腺修飾組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 豚鼠到大鼠心臟異種移植中，豚鼠MSCs修飾大鼠胸腺，當(dāng)克服HAR后可以延長供心存活時間，但并不能完全克服AVR的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 胸腺修飾；異種心臟移植；免疫耐受；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

[中圖分類號] R392.4；R654.2???[文獻標(biāo)識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2012）21-35-04

Effect of intrathymic inoculation to cardiac xenograft rejection with mesenchymal stem cells

ZHU?Zhen1??SHEN?Zhenya1??CHEN?Haijun2

1.Department of Cardiothoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou 215006，China；2. Department of Thoracic Surgery， the Affiliated Kunshan Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Kunshan 215300， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathymic inoculation with guinea pig's MSCs on the discordant rodent cardiac xenograft in the model of guinea pig to rat xenotransplantation. Methods Donor （twenty guniea pigs） and recipient （twenty SD rats） were randomly divided into four groups， including group A （control group）， group B （IT group）， group C （CVF group）， group D （CVF plus IT inoculation with MSCs group）.The guinea pig's grafted heart mean survival time， the optical density of mixed cell reaction and the pathology were observed. Results MST of group A was （23.20±6.14）min， group B was （24.20±9.28）min， group C was （335.40±49.23）min， and group D was （451.00±50.10）min. The difference between group A and group B was not statistically significant （P>0.05）.Group C and group D were significantly longer than that of group A and group B（P<0.05）. The difference of MST was statistically significant in group D and group C （P<0.05）.The results of MCR of group IT was （381.20±12.01）. Control group was （590.20±15.38）. The optical density of group IT was much lower than control group （P<0.05）. Conclusion Intrathymic inoculation with MSCs of guinea pig can prolong the survival time of xenoheart by using Chinese cobra venom factor.

[Key words] Intrathymic inoculation； Cardiac xenotransplantaion； Immunotolerance； Bone mesenchymal stem cells

選用豚鼠到大鼠心臟異位移植模型作為實驗?zāi)Ｐ?。目前超急性排異反?yīng)（HAR）已能被中華眼鏡蛇毒因子（CVF）所克服，急性血管性排斥反應(yīng)（AVR）是目前異種移植所面臨的主要問題。本研究通過間充質(zhì)干細(xì)胞修飾胸腺來研究該方法對AVR的影響，以了解此方法對異種移植的影響。

1?材料與方法

1.1?主要試劑

Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（SIGMA公司）；DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；中華眼鏡蛇毒因子（CVF）（昆明倍捷公司）；CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）。

1.2?手術(shù)材料

二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus.BB 5060）；8-0無創(chuàng)傷縫線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司）；手術(shù)顯微鏡（YZ 20T-Ⅲ型）；超速冷凍離心機（Juoan MR1812 Inc.France）。

1.3?實驗動物

豚鼠選擇要求：雄性，健康，體重控制在400～450 g；大鼠選擇要求：健康，SD雌性大鼠，體重控制在250～300 g。

1.4?實驗方法

1.4.1?全骨髓貼壁篩選法?MSCs分離、培養(yǎng)、擴增。取三色豚鼠四肢長骨，抽取得到骨髓加入Ficoll分離液中進行30 min離心作用；用DMEM液調(diào)整吸取到的單個核細(xì)胞層中單核細(xì)胞密度，按1×106/L的密度分裝接種于培養(yǎng)瓶中。在CO2（體積分?jǐn)?shù)為5%）、含飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中對培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時進行傳代。當(dāng)這些傳代細(xì)胞完全融合時得到的即為BM-MSCs[1-2]，然后進行胰酶消化，吹打，制成細(xì)胞懸液。

1.4.2?胸腺修飾?大鼠取胸骨上部正中切口，暴露胸腺，胸腺內(nèi)注射0.1 mL MSCs（1×105個/0.1 mL/次）。用4號針頭緩慢注入，常規(guī)結(jié)扎穿刺點。注射結(jié)束后用生理鹽水反復(fù)沖洗胸腺周圍組織。

1.4.3?實驗分組?供體豚鼠和受體SD大鼠各20只隨機分成四組，每組5只，A組（對照組）；B組（胸腺修飾IT組）；C組（CVF組）；D組（IT加CVF組）。A組做豚鼠到大鼠異位異種腹腔心臟移植，不對受體做特殊處理；B組供體豚鼠MSCs胸腺修飾受體大鼠第15天后，進行豚鼠到受體大鼠異位異種腹腔心臟移植；C組術(shù)前24 h受體僅接受CVF預(yù)處理，然后行異種異位移植；D組（CVF+IT組）：受體接受供體MSCs胸腺注射及術(shù)前CVF預(yù)處理，再行異種異位移植。

1.4.4?建立大鼠腹腔異位心臟移植模型（Ono's術(shù)式）?采用成熟的改良Ono's術(shù)式進行手術(shù)，供心采?。弘嗍舐樽?，固定，消毒，抗凝，暴露胸腔。保留升主動脈和肺動脈，其余血管均予以結(jié)扎。經(jīng)主動脈反復(fù)將供體心臟血液沖洗干凈（采用肝素生理鹽水），洗后放置冰生理鹽水中備用。大鼠麻醉，固定，消毒后進行受體心臟移植，顯微鏡下進行手術(shù)，進腹，將供體心臟的升主動脈與受體大鼠腹主動脈，供心肺動脈與供體下腔靜脈行端側(cè)吻合，血管吻合采用二定點吻合法。

1.5?檢測指標(biāo)和術(shù)后觀察

1.5.1?移植術(shù)后供心存活時間的觀察?供體移植心臟開始復(fù)跳至心臟停跳的時間作為移植心臟存活的時間。術(shù)后通過觸摸大鼠腹部觀察移植心臟是否跳動，視心臟跳動情況，以每2小時、1小時、10分鐘為時間段，逐步縮短觀察間隔時間。

1.5.2?供體心臟的病理觀察?供體豚鼠心臟停跳后立即從腹腔取出，10%甲醛溶液固定供體心臟心肌組織，石蠟包塊固定后的心肌組織，并做石蠟切片。光學(xué)顯微鏡下觀察染色[常規(guī)伊紅-蘇木素（HE）]后心肌結(jié)構(gòu)的病理變化。

1.5.3?供受體淋巴細(xì)胞毒性試驗（MLC）?分兩組進行淋巴細(xì)胞毒性試驗：對照組：不做任何處理的大鼠淋巴細(xì)胞+豚鼠淋巴細(xì)胞；B胸腺修飾組：經(jīng)供體豚鼠MSCs胸腺注射后第15天大鼠的脾臟淋巴細(xì)胞+豚鼠淋巴細(xì)胞。首先將豚鼠、大鼠的脾臟制成淋巴細(xì)胞懸液，刺激細(xì)胞為供體豚鼠淋巴細(xì)胞，反應(yīng)細(xì)胞受體大鼠淋巴細(xì)胞，絲裂霉素處理供體淋巴細(xì)胞，供、受體淋巴細(xì)胞均制備成終濃度為1.0×106/mL的細(xì)胞懸液。在培養(yǎng)孔中注入均為100 μL的供體刺激細(xì)胞和受體反應(yīng)細(xì)胞，在5% CO2，濕度100%、溫度37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，加入CCK-8后繼續(xù)進行4 h的培養(yǎng)后吸取上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）液，在酶標(biāo)儀上測吸光度（OD）值。根據(jù)公式：刺激效應(yīng)=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/空白對照組OD值×100%，計算刺激效應(yīng)。

1.6?統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料采用（）表示，進行t檢驗，計數(shù)資料卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?MSCs分離、培養(yǎng)、擴增（全骨髓貼壁篩選法）

原代細(xì)胞培養(yǎng)約14～16 d后，融合率可達(dá)80%～90%，融合后細(xì)胞群呈旋渦狀，見圖1；2代細(xì)胞24 h內(nèi)培養(yǎng)即可呈現(xiàn)完全貼壁形態(tài)分布，見圖2；3～10代有4～5 d的細(xì)胞生長周期，呈現(xiàn)的比較單一的細(xì)胞形態(tài)，大部分細(xì)胞呈梭形，少部分呈多角形，見圖3。

2.2?4組大鼠移植心臟的存活時間

移植心臟復(fù)跳開始計時，到移植手術(shù)后通過腹部觸診心臟停止跳動為止，此段時間為移植心臟存活時間的測定依據(jù)。4組大鼠移植心臟存活時間顯示，A組平均存活時間最低，B組平均存活時間也較短，但與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。C、D組平均存活時間明顯增加，與A、B組比較明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。D組平均存活時間最長，與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3?各組豚鼠心肌結(jié)構(gòu)顯微觀察結(jié)果

正常心臟冠狀動脈內(nèi)管壁光整，無中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞附壁、浸潤現(xiàn)象，只有少量紅細(xì)胞附著于管壁上，無明顯血栓形成，高倍鏡下見小冠狀動脈、靜脈壁內(nèi)膜光整無破壞。見圖4。

顯微鏡下觀察到A、B兩組供體心臟均有HAR現(xiàn)象發(fā)生，移植心臟內(nèi)可見緊密連粘的血栓與管壁，血管內(nèi)血栓廣泛形成，血管外有出血，管壁水腫導(dǎo)致觀察到少量的單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞附壁、浸潤，管壁不光整。心肌細(xì)胞間血管見血栓形成，內(nèi)膜不完整，有破壞、突起、增厚，內(nèi)膜表面見膜樣隔離層，見圖5。C、D組供心發(fā)生AVR，而發(fā)生AVR的心臟，導(dǎo)致心肌缺血性梗死現(xiàn)象出現(xiàn)，觀察到心肌細(xì)胞內(nèi)有大量的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，還出現(xiàn)凝固性壞死，有血栓形成于微血管內(nèi)，血管外少量出血，見圖6。

2.4?供受體脾淋巴細(xì)胞毒性試驗（MLC）

效應(yīng)細(xì)胞為第15天經(jīng)胸腺修飾后的大鼠脾淋巴細(xì)胞，刺激細(xì)胞為豚鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理后的細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞和CCK-8行單向混合后進行細(xì)胞培養(yǎng)?？瞻捉M、對照組與胸腺修飾組的MLR測定結(jié)果平均值見表2，分別為0.40±0.23、2.76±0.10、1.93±0.03，3組的MLR測定結(jié)果呈增殖反應(yīng)。胸腺修飾組、對照組的刺激效應(yīng)平均值分別為：381.20±12.01和590.20±15.38，可見胸腺修飾組的受體淋巴細(xì)胞刺激效應(yīng)平均值較對照組顯著減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3?討論

眾多國內(nèi)外學(xué)者的大量系統(tǒng)研究證實，同種嚙齒目小動物胸腺修飾后可在心臟移植模型中成功誘導(dǎo)出“永久性、特異性”的獲得性免疫耐受[3-5]。其中沈振亞等[6]研究發(fā)現(xiàn)異種胸腺修飾后的受體，經(jīng)過輻射照射后，第7天能抑制IgG類天然抗體的生成。已經(jīng)有實驗證明豚鼠間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在大鼠胸腺中存活，且豚鼠MSCs在受體大鼠胸腺微環(huán)境的影響下，可以向環(huán)境中多種細(xì)胞分化。從免疫角度看，MSCs本身具有低免疫原性，機體的免疫排斥反應(yīng)因為這樣獨特的免疫學(xué)特性會降至很低，從而可以更有效的逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）的殺傷作用[7]；在免疫系統(tǒng)中MSCs具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞功能的作用[8-9]，使所在機體的免疫反應(yīng)降低，表現(xiàn)出一定的免疫調(diào)節(jié)作用。骨髓MSCs本身具有生長分化可適應(yīng)性的變化并隨環(huán)境定向分的特性。Sallusto F等[10]研究結(jié)果也證實了這一點，大鼠心肌被注入標(biāo)記后的MSCs細(xì)胞，移植細(xì)胞經(jīng)4～6周后完全分化出與正常心肌細(xì)胞及相似的結(jié)構(gòu)，表明間充質(zhì)干細(xì)胞的生長分化隨心肌組織微環(huán)境發(fā)生了適應(yīng)性的變化，隨環(huán)境定向分化。

本研究中，研究異種移植排斥反應(yīng)最常見的動物模型是豚鼠到大鼠的異種移植模型，探討異種間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過修飾胸腺后能否抑制誘生抗體的產(chǎn)生。選用該模型作為異種心臟移植的實驗平臺，異種間的研究方向為異種抗原修飾胸腺，由于骨髓中骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.01%是MSCs的[10]，MSCs本身具有生長分化可適應(yīng)性的變化并隨環(huán)境定向分的功能，這是選擇修飾胸腺的抗原細(xì)胞的基礎(chǔ)，MSCs在受體中更能長時間的存在并發(fā)揮“馴化”受體T細(xì)胞的作用。其次是區(qū)別其他胸腺修飾實驗，不對受體進行輻射照射，相對而言受體具有溫和、低毒等優(yōu)點，適當(dāng)?shù)难娱L胸腺修飾的時間更好的進行陰性選擇，這也受益于MSCs能夠在受體胸腺中長時間的存活。

筆者認(rèn)為，豚鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性使其能夠在大鼠異種環(huán)境體內(nèi)下存活進而分化，是本心臟移植實驗的良好的免疫基礎(chǔ)。根據(jù)其適應(yīng)性分化特性，MSCs向胸腺間質(zhì)細(xì)胞等具有抗原提呈功能的細(xì)胞分化，大鼠T細(xì)胞必須在大鼠本身胸腺內(nèi)成熟發(fā)育，根據(jù)胸腺的陰性選擇機制，T細(xì)胞受到豚鼠MSCs及其分化細(xì)胞的“馴化”作用，對豚鼠抗原的中樞性免疫產(chǎn)生耐受作用。筆者認(rèn)為大鼠體內(nèi)豚鼠間充質(zhì)干細(xì)胞能夠生存并參與T細(xì)胞陰性選擇，主要是MSCs本身具有的相對低抗原性、MSCs有抑制T細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，而且胸腺是免疫系統(tǒng)的特區(qū)，有可能會因MSCs這兩種特性使免疫系統(tǒng)的攻擊減少或避免。

本研究單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果可見，大鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)供體干細(xì)胞胸腺修飾后，相對于供體豚鼠免疫反應(yīng)受到抑制，對豚鼠來源的抗原反應(yīng)性明顯降低。B組和D組胸腺修飾組中，供體豚鼠脾細(xì)胞被大鼠脾細(xì)胞刺激后的MLR值明顯降低，即針對豚鼠淋巴細(xì)胞的應(yīng)答受抑制；而未胸腺修飾組，大鼠脾細(xì)胞和供體豚鼠脾細(xì)胞刺激后淋巴細(xì)胞反應(yīng)呈增殖反應(yīng)，4組MLR值比較來看，A組和C組較B、C組明顯偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。本研究還可以看到A組和B組供心存活時間兩者之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。因為兩組均發(fā)生了超急性排斥反應(yīng)，從A組和B組的病理切片中可以明確判斷出。單純胸腺修飾組也發(fā)生了，而且程度并未減輕。而C組和D組均使用CVF克服HAR，兩者供心呈延遲性異種排斥反應(yīng)改變的病理特征，且比較典型。表明單純進行胸腺修飾不能抑制異種移植過程中HAR的產(chǎn)生。

本研究證明在克服超急性排異反應(yīng)后，胸腺修飾的有效性，但仍然發(fā)現(xiàn)胸腺修飾并不能使供心長時間存活。從供心存活時間來看，A、B組的供心存活時間較克服了HAR的D組明顯縮短不少，A、B組的供心存活時間同樣較克服了HAR的C組明顯縮短，但縮短時間要明顯少于與D組相比，更將充分證明了本研究采用MSCs胸腺修飾的有效性。研究中未能長期存活的D組的供心，其原因主要可能為AVR中非T細(xì)胞依賴性的抗供體抗體的作用，AVR反應(yīng)中其他免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用等。免疫系統(tǒng)的研究復(fù)雜繁瑣，類似于網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，本研究通過間充質(zhì)干細(xì)胞修飾胸腺來研究該方法對AVR的影響，以了解此方法對異種移植的影響。但要實現(xiàn)理論上本研究單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果可見，大鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)供體干細(xì)胞胸腺修飾后，相對于供體豚鼠免疫反應(yīng)受到抑制，對豚鼠來源的抗原反應(yīng)性明顯降低。

[參考文獻]

[1] Reisner Y，Gur H，Reich-Zeliger S，et al.Hematopoietic stem cell transplantation across major genetic barriers：tolerance induction by megadose CD34 cells and other veto cells[J].Ann N Y Aca Sciences，2003，996：72-79.

[2] Millan MT，Shizuru JA，Hoffmann P，et al.Mixed chimerism and immuno-suppressive drug withdrawal after HLA-mismatched kidney and hematopoietic progenitor transplantation[J].Transplantation，2002，73（9）：1386-1391.

[3] Bosnakovski D，Mizuno M，Kim Q，et al.Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells[J].Cell Tissue Res，2005，319（2）：243-253.

[4] Obatake M，Kushida M，Kimmel S，et al.T cells are necessary and critical for xenograft rejection in new concordant cardiac xenotransplant model[J].Transplantation，1999，67（11）：1480-1484.

[5] Sato K，Takigami K，Miyatae T，et al.Suppression of delayed xenograft rejection by specific depletion of elicited antibodies of the IgM isotype[J].Transplantation，1999，68（6）：844-854.

[6] 沈振亞，倪斌，何建明，等.異種胸腺修飾對大鼠抗豚鼠天然抗體產(chǎn)生的影響現(xiàn)代免疫學(xué)[J].2004，24：305-307.

[7] Klyushnenkova E，Mosca JD，Zernetkina V，et al.T cell responses to allogeneic human mesenchymal stem cells：immunogenicity，tolerance，and suppression[J].J Biomed Sci，2005，12（1）：47-57.

[8] Bartholomew A，Sturgeon C，Siatskas M，et al.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo[J].Exp Hematol，2002，30（1）：42-48.

[9] Zhu J，Yamane H，Cote-Sierra J，et al.GATA-3 promotes Th2 responses through three different mechanisms：induction of Th2 cytokine production，selective growth of Th2 cells and inhibition of Th1 cell-specific factors[J].Cell Research，2006，16（1）：3-10.

[10] Sallusto F，Mackay CR，Lanzavecchia A.Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2 cells[J].Science，1997，277（5334）：2005-2007.

（收稿日期：2012-06-18）