滕崢，張曦

上海市疾病預(yù)防控制中心, 上海 200336

根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)分類，人腸道病毒(human enterovirus，HEV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)中的腸道病毒屬。HEV在外環(huán)境中普遍存在，室溫下可存活數(shù)日，污水和糞便中可存活數(shù)月，冰凍條件下可保存數(shù)年。隱性感染者和患者是HEV感染的主要傳染源，也是造成疾病傳播難以控制的主要原因之一。HEV的流行地區(qū)極為廣泛。不同種類和型別的HEV感染的流行季節(jié)不完全相同，高峰季節(jié)為夏秋季。人體對(duì)不同種類和型別的HEV亦可重復(fù)感染。雖然各年齡段均可受累，但學(xué)齡前兒童患者的比例顯著高于青少年和成年人。

1 HEV的發(fā)現(xiàn)歷史及其分類

HEV的分離經(jīng)歷了從靈長(zhǎng)類動(dòng)物開始轉(zhuǎn)至小動(dòng)物及應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的漫長(zhǎng)過程。1909年，將脊髓灰質(zhì)炎患者的糞便標(biāo)本接種于猴子體內(nèi)，首次鑒定了脊髓灰質(zhì)炎病毒。1948年，用接種乳鼠方法分離到柯薩奇病毒。1951年，通過細(xì)胞培養(yǎng)分離到多種?？刹《尽３c人類健康有關(guān)的HEV(包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒)各血清型別外，1969年后研究者又陸續(xù)分離出一些抗原性不同于以往的HEV。ICTV決定將從HEV68型起的新型HEV按序號(hào)命名。目前世界公認(rèn)的HEV有近70個(gè)血清型[1-3]，100多個(gè)基因型[4,5]。

目前，HEV的分類方式有基于血清中和試驗(yàn)的傳統(tǒng)分類法和基于HEV-VP1核甘酸序列的基因型別分類法(血清型和基因型分組見表1)。傳統(tǒng)分類法經(jīng)ICTV第8次會(huì)議反復(fù)修訂后，將?？刹《?3型與9型合并為埃可病毒9型，?？刹《?型與1型合并為?？刹《?型，柯薩奇病毒A15型與A11型合并為柯薩奇病毒A11型，柯薩奇病毒A18型與A13型合并為柯薩奇病毒A13型，埃可病毒34型與柯薩奇病毒A24型合并為柯薩奇病毒A24型變種，鼻病毒87型重歸為HEV68型。?？刹《?0型、22型、23型和HEV72型被劃撥到其他病毒屬。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，各國研究者陸續(xù)開展用分子分型技術(shù)尋找對(duì)應(yīng)HEV血清型的研究，以便能高通量、快速地鑒定。經(jīng)過近10年的努力，分子分型技術(shù)不僅可替代傳統(tǒng)的HEV血清型鑒定技術(shù)，還可發(fā)現(xiàn)變異株和重組株，為HEV基因型別分類和免疫學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

表1人腸道病毒傳統(tǒng)分類和基因分類匯總表[3,5]

Tab.1Traditionalclassificationandgeneclassificationofhumanenterovirus

Traditional classificationVirusSerotypeGene classificationVP1 genotypingSerotypePoliovirus (PV)1-3 (3)HEV-ACVA2-8,10,12,14,16; HEV71,76,89-92 (17)Coxsackievirus A (CVA)1-14,16,17,19-22,24 (21)HEV-BECHO1-7,9,11-21,24-27,29-33;CVB1-6;CVA9;HEV69,73-75,77-88,93,97,98,100,101,106,107 (58)Coxsackievirus B (CVB)1-6 (6)HEV-CPV1-3;CVA1,11,13,17,19-22,24;HEV95,96,99,102-105,109 (20)Echovirus (ECHO)1-7,9,11-21,24-27,29-33 (28)HEV-DHEV68,70,94 (3)New enterovirus68-71 (4)UndeterminedHEV106,108,112,113 (4)

2 HEV的傳播途徑

HEV在自然環(huán)境中長(zhǎng)期存在。當(dāng)攜帶HEV的糞便污染了地表水、地下水、土壤及生活廢棄物時(shí)，人類食用的海產(chǎn)品、谷物、飲用水及其他食品就有HEV被富集而受污染的可能。意大利[6]、摩洛哥[7]研究者對(duì)蚌進(jìn)行HEV檢測(cè)，約在10%蚌標(biāo)本中檢測(cè)到HEV。墨西哥研究者[8]對(duì)牡蠣進(jìn)行檢測(cè)，42%標(biāo)本HEV陽性。美國夏威夷研究者[9]在9個(gè)海灘采樣點(diǎn)中6個(gè)點(diǎn)的貝類檢測(cè)到HEV，22份再循環(huán)水處理點(diǎn)標(biāo)本中11份HEV檢測(cè)陽性。我國深圳龍崗區(qū)研究者[10]做了一項(xiàng)外環(huán)境水體中HEV的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)水體中HEV總檢出率為88.2%。武漢[11]調(diào)查結(jié)果顯示，源水中46%、飲用水中21%檢測(cè)出HEV。全球脊髓灰質(zhì)炎監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室全年對(duì)環(huán)境中HEV進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估，盡管許多國家沒有報(bào)道急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)病例，但從環(huán)境中可檢測(cè)到脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株。在中國內(nèi)地，水體中HEV年平均檢出率為30%左右。一旦這些被HEV污染的水或食物處理不當(dāng)就會(huì)通過人體口腔、呼吸道、黏膜等進(jìn)入靶器官復(fù)制，引發(fā)相應(yīng)的疾病。近年來，研究者還發(fā)現(xiàn)了傳播HEV的其他途徑。2006年，臺(tái)灣Chang等[12]從母乳中分離到柯薩奇病毒B3型。2008年，美國Maus等[13]從一位新生兒敗血癥患兒母親的母乳中分離到?？刹《?8型，進(jìn)一步證實(shí)母乳也能傳播HEV的事實(shí)。傳播途徑的多樣性也是HEV難以預(yù)防和控制的原因之一。

3 目前常用的HEV檢測(cè)技術(shù)

1950年前，分離和鑒定HEV的方法只有通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)，并分離了脊髓灰質(zhì)炎病毒和柯薩奇病毒。1950年后，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使HEV研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了第1次飛躍[14]，也為HEV血清型的鑒定奠定了基礎(chǔ)。1985年，美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR), 使人們夢(mèng)寐以求的體外無限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。從此，常見又具有特異臨床表現(xiàn)的HEV血清型快速篩查手段得以發(fā)展。

3.1 病毒分離與鑒定

病毒分離與鑒定的標(biāo)本來自于受到攻擊的靶器官/組織和相關(guān)體液。不同血清型的HEV其結(jié)合細(xì)胞的受體有所不同，故使用多種細(xì)胞用于病毒分離可提高病毒培養(yǎng)的靈敏度、增強(qiáng)病毒感染滴度。常用的HEV分離的敏感細(xì)胞有Vero、Hep-2、HeLa、RD等。雖然該技術(shù)也存在缺陷(對(duì)柯薩奇病毒A組的病毒很難分離，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，耗時(shí)，耗人力，不能滿足高通量和快速篩查的需要)，但到目前為止，細(xì)胞培養(yǎng)和依賴于細(xì)胞培養(yǎng)的中和試驗(yàn)法仍是病毒分離、毒株傳代和血清型鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3,5]。近年來，研究者[15]研發(fā)了混合細(xì)胞系，目的在于通過應(yīng)用多種細(xì)胞混合培養(yǎng)，節(jié)省人力，節(jié)約標(biāo)本量；并在同一反應(yīng)體系中為病原體培養(yǎng)提供多種細(xì)胞系，提高病毒的分離成功率。

3.2 血清學(xué)試驗(yàn)

血清學(xué)試驗(yàn)并不是目前散發(fā)HEV感染病例病原診斷的常用方法之一。一般需取發(fā)病早期和恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，若血清特異性抗體有4倍及以上增加，則有診斷意義，然而臨床上獲取雙份血清存在操作上的局限性。大多數(shù)情況下，檢測(cè)患者血清特異性IgM抗體可提供目前正在感染的依據(jù)，但要考慮到健康人群中抗體高低對(duì)IgM檢測(cè)結(jié)果的影響[5]。2008年手足口病作為丙類傳染病被列入《中華人民共和國傳染病防治法》，HEV71型IgM抗體檢測(cè)試劑作為疾病早期診斷試劑，其研發(fā)工作得到進(jìn)一步推動(dòng)，中國國家疾病預(yù)防控制中心參與了試劑質(zhì)量的評(píng)估[16]。結(jié)果顯示，12%的患者在發(fā)病第1天便可檢測(cè)到特異性IgM抗體，95%以上的患者在4 d后的血清中檢測(cè)到HEV71型IgM抗體，HEV71型感染與其他HEV感染的交叉反應(yīng)率約為11.4%。研究者認(rèn)為，HEV71型IgM血清學(xué)診斷可為其感染的早期診斷提供幫助。國外也有報(bào)道[17,18]在處理HEV引起的暴發(fā)事件中，HEV特異性IgM抗體檢測(cè)不失為一種快速篩查的手段。

3.3 分子分型技術(shù)

HEV基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)7.2～8.5 kb，兩端為保守的非編碼區(qū)，同源性非常高，中間為連續(xù)開放讀碼框架。此外，5′端有以共價(jià)結(jié)合的約23個(gè)氨基酸組成的病毒基因組連接蛋白(viral genome-linked protein，Vpg)，3′端帶有多聚腺苷酸(poly A)尾[19]。病毒RNA編碼4個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼的表面，VP4位于衣殼內(nèi)部。VP1區(qū)域存在HEV中和抗原決定簇位點(diǎn)[20]，這正是分子分型技術(shù)鑒定不同型別HEV的基礎(chǔ)。衣殼蛋白VP1區(qū)域具有與HEV血清型完全對(duì)應(yīng)的遺傳多樣性，VP1區(qū)域不僅可作為HEV屬內(nèi)不同血清型分類的依據(jù)，還可作為小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考。Chu等[21-23]則通過實(shí)驗(yàn)證明VP4的核甘酸序列相對(duì)保守，變異幅度僅為17.5%～24.4%，因此VP4區(qū)域也可用于分子流行病學(xué)和基因分型的研究靶片段。馬來西亞、日本、澳大利亞多國研究者[24,25]對(duì)VP1、VP2和VP4區(qū)域HEV分子分型的符合率進(jìn)行比較，HEV-A組病毒分型結(jié)果的符合率為100%。雖然VP2、VP4區(qū)域分別與VP1區(qū)域病毒分型結(jié)果高度符合，但VP2、VP4區(qū)域分型結(jié)果不能涵蓋HEV-B和HEV-C組的所有病毒。

20世紀(jì)90年代末，Oberste等[23]設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HEV VP1部分序列，將獲得的核甘酸序列與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)毒株序列進(jìn)行對(duì)比，以此來判斷HEV血清型別。自此，分子分型技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用促使HEV研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)第2次飛躍。越來越多的研究者對(duì)HEV VP1區(qū)域擴(kuò)增引物進(jìn)行改良和修飾[5]。到目前為止，對(duì)傳統(tǒng)法可鑒定的血清型，分子分型技術(shù)同樣可鑒定出來，且獲得更多的基因型別，這為HEV的變異研究拓展了方向。近年來，美國疾病預(yù)防控制中心已用分子分型技術(shù)替代了傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)法，從而對(duì)HEV血清型進(jìn)行快速篩查和鑒定。

4 HEV感染引起的疾病

HEV侵入呼吸道、咽喉和腸道，先在局部黏膜和咽、扁桃體等淋巴組織和腸道集合淋巴結(jié)中初步增殖，然后釋放入血，形成第1次病毒血癥，隨后擴(kuò)散至帶有受體的靶器官，再次增殖，引起第2次病毒血癥和臨床癥狀。大多數(shù)HEV感染引發(fā)的是溫和的自限性疾病，少數(shù)可引起重癥甚至死亡。不同種類和型別的HEV受體不完全相同，因此一種血清型的HEV可引發(fā)多種疾病，一種疾病可由多種血清型的HEV引起[26]。多數(shù)HEV的受體在組織和細(xì)胞中廣泛分布，包括神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心臟、皮膚/黏膜、肌肉、胰腺、腎上腺等靶器官，引起腦(膜)炎、支氣管炎、心肌炎、手足口病、弛緩性麻痹、糖尿病等疾病(表2)。全球流行病與傳染病資源信息顯示，1948年起英國就有HEV暴發(fā)，每年全球包括發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家均有HEV暴發(fā)的報(bào)道，至今已有228個(gè)國家報(bào)道了HEV暴發(fā)事件。最常見的疾病有手足口病、腦(膜)炎和急性呼吸道感染性疾病。

表2腸道病毒相關(guān)疾病

Tab.2Diseasesassociatedwithhumanenteroviruses

Clinical syndromes PoliovirusCoxsackievirus A Coxsackievirus B EchovirusParalytic diseases++++Aseptic meningitis++++Myocarditis++++Neonatal enterovirus diseases--++Epidemic pleurodynia--++Herpangina-+--Epidemic conjunctivitis-+--Acute respiratory diseases++++Fever of unknown origin++++Type 1 diabetes mellitus--+-

4.1 手足口病

手足口病中主要病原體為HEV71型和柯薩奇病毒A16型，少數(shù)病例由柯薩奇病毒A4、A5、A7、A9、A10、B5、B6型引起[27-32]。多見于5歲以下兒童。病毒侵犯口腔黏膜或皮膚上皮細(xì)胞，導(dǎo)致口腔潰瘍性損傷和皮膚斑丘疹。早期表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力，可出現(xiàn)噴嚏、咳嗽、流涕等感冒樣癥狀，也可出現(xiàn)食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛等胃腸道癥狀。其特征性表現(xiàn)為痛性口腔潰瘍和無痛性皮膚斑丘疹?？谇粷円话阍?～7 d內(nèi)緩解，皮膚斑丘疹一般在5～10 d內(nèi)結(jié)硬皮并逐漸消失。絕大多數(shù)手足口病患者預(yù)后良好，病死率低于1%。有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肺臟并發(fā)癥的重型患者是手足口病死亡的高危人群。中國自1981年上海報(bào)道手足口病以來，各省每年均有散發(fā)和暴發(fā)病例。2008年安徽阜陽暴發(fā)手足口病后，因病死率高而引起廣泛重視，衛(wèi)生部將手足口病列入法定丙類傳染病進(jìn)行監(jiān)管。近幾年來，除HEV71型和柯薩奇病毒A16型仍是手足口病散發(fā)、聚集和暴發(fā)的最常見病原體外，在法國[33]、美國[34]及我國部分地區(qū)均出現(xiàn)了由柯薩奇病毒A6型、A10型感染引起的暴發(fā)事件。但手足口病的主要流行地區(qū)還是在東南亞，在越南、中國臺(tái)灣和中國內(nèi)地流行的HEV71型病毒株的基因型以C4亞型為主[35]。

4.2 病毒性腦(膜)炎

全球流行病與傳染病資源信息顯示，HEV性腦膜腦炎以?？刹《竞涂滤_奇病毒引起的為主，占非脊髓灰質(zhì)炎型HEV性腦膜腦炎的90%以上。約半數(shù)病毒性腦膜炎或腦膜腦炎暴發(fā)由?？刹《?0型引起。美國不同地區(qū)文獻(xiàn)資料顯示[36-39]，HEV感染引發(fā)的腦(膜)炎占無菌性腦(膜)炎的5%左右。印度研究者[40]匯總了2009～2010年的資料，顯示HEV引發(fā)的腦(膜)炎病例占全部腦(膜)炎病例的25%。北京[41]1996年的一項(xiàng)調(diào)查中顯示，兒童急性腦(膜)炎中15.5%是由HEV引起的。在甘肅省[42]用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)病毒性腦(膜)炎標(biāo)本中HEV IgM，陽性率為8.75%。在上海對(duì)診斷疑似乙型腦炎的2004、2005和2010年患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行HEV核酸檢測(cè)，陽性率為30%左右。由于目前各地區(qū)對(duì)HEV引起的腦(膜)炎檢測(cè)的標(biāo)本種類和采樣年齡不同，所以檢測(cè)結(jié)果差距較大。2007年起，我國的云南、山東，以及西班牙和印度都報(bào)道了新型HEV75型感染導(dǎo)致的病毒性腦(膜)炎病例[43-45]，因此HEV引起的病毒性腦(膜)炎越來越受重視。

HEV感染引起的腦(膜)炎多見于兒童，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛和腦膜刺激等癥狀，多數(shù)呈輕型，在1周內(nèi)完全恢復(fù)，通常無明顯不良后果；但腦膜腦炎可留中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。2008年手足口病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)以后，腦膜刺激癥狀為判斷手足口病重癥的標(biāo)準(zhǔn)之一。

4.3 呼吸系統(tǒng)疾病

許多國家如美國、德國、韓國、日本等將HEV視作普通感冒或流行性感冒樣病例的重要病原體。2008～2010年，亞洲、歐洲和美國相繼報(bào)道新型HEV68型導(dǎo)致的支氣管炎和肺炎[46]。北京首都兒科研究所2007年[47]報(bào)道，在402份標(biāo)本中檢出70份HEV陽性，陽性率為17.4%；下呼吸道感染HEV陽性率為17.7%，上呼吸道感染HEV陽性率為15.9%。近幾年來，也出現(xiàn)了HEV109型引起的兒童急性呼吸道感染的報(bào)道[48,49]，陽性檢出率分別為1.1%和1.6%。

5 展望

HEV分布廣泛、種類繁多，引起的疾病呈多樣性。雖然5歲以下兒童更易受到HEV的侵犯，但全年齡組人群都會(huì)受到不同種類HEV的感染而引發(fā)相應(yīng)疾病。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，變異及重組HEV對(duì)人類健康的威脅正被不斷報(bào)道。近3年來，全球范圍內(nèi)包括美國、墨西哥、英國、中國、新加坡、印度等均有手足口病暴發(fā)的報(bào)道，常見的病原體除HEV71型和柯薩奇病毒A16型外，柯薩奇病毒A6型和A10型引起的手足口病暴發(fā)日漸增多。自2010年起，全球范圍內(nèi)由HEV68型引起的感染也時(shí)有發(fā)生，通常引起呼吸道感染。近5年的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料顯示，非脊髓灰質(zhì)炎型HEV性腦膜腦炎占病毒性腦膜腦炎的35%～80%。

鑒于HEV的型別多、所致疾病多樣化，今后如能加強(qiáng)臨床與基礎(chǔ)結(jié)合的病因?qū)W研究，將有可能發(fā)現(xiàn)新的HEV型別及疾病。為提高全民意識(shí)、提升臨床醫(yī)師的認(rèn)知及減輕HEV感染導(dǎo)致的隱性疾病負(fù)擔(dān)，加強(qiáng)對(duì)HEV的監(jiān)測(cè)和篩查不容忽視。此外，根據(jù)HEV的共有特點(diǎn)，研發(fā)共有的疫苗與藥物也是值得重視的切入點(diǎn)。

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