楊錦，李丹，王繼寶，李艷玲，段星，項麗芬，葉潤華，楊躍誠，龔渝蓉，高潔，蔣巖，段松

1. 德宏傣族景頗族自治州疾病預防控制中心，芒市 678400; 2. 中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206

云南省德宏傣族景頗族自治州(簡稱德宏州)于1989年在靜脈注射毒品者(injection drug user，IDU)中發(fā)現了我國最早出現的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染局部暴發(fā)[1]，并繼而成為云南省乃至全國艾滋病流行最嚴重的地區(qū)之一。及時發(fā)現HIV感染者是有效防止HIV傳播的首要環(huán)節(jié)，抗體檢測則是診斷HIV感染的主要依據。德宏州疾病預防控制中心確證實驗室承擔著全州HIV抗體初篩陽性樣本的最終確認，對高危人群采用替代檢測策略進行確證；對達不到替代策略判定陽性標準的樣本，采用蛋白免疫印跡法(Western blotting, WB)進行確證[2]。WB結果判定為3種：HIV抗體陽性、HIV抗體陰性和HIV抗體不確定。對于HIV抗體不確定的受檢者，需結合流行病學資料并進行隨訪復檢，最終才能確定結果。這樣不但對受試者帶來極大的心理壓力，而且對艾滋病的實驗室檢測和疫情管理也會增加很多困難。因此，如何盡早作出明確診斷是亟待解決的問題。

本文對2008～2011年德宏州發(fā)現的篩查試驗陽性而WB結果為HIV抗體不確定的49例受檢者進行分析，并對其中27例隨訪跟蹤，進一步探討HIV抗體不確定結果的特點并提出更合理的處理方法，為檢測工作和結果的分析及處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2008～2011年德宏州疾病預防控制中心艾滋病確證實驗室49例HIV抗體不確定的受檢者檢測結果及流行病學資料，并對其中27例進行隨訪追蹤。

1.2 試劑

酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑購自北京華大吉比愛生物技術有限公司和上海梅里埃生物工程有限公司，均為第3代診斷試劑。確證試驗采用WB，使用MP生物醫(yī)學亞太有限公司出產的HIV Blot 2.2試劑盒。所有試劑均由云南省疾病預防控制中心統(tǒng)一下發(fā)，并在限期內嚴格按照說明書操作。

1.3 方法

全州各HIV檢測篩查實驗室及檢測點初篩陽性的樣本，以及到德宏州疾病預防控制中心自愿咨詢檢測者(voluntary counseling and testing，VCT)的初篩陽性標本，經ELISA替代檢測后，如果其中一種ELISA試劑檢測結果的樣品吸光度/臨界值(sample/cutoff,S/CO)比值在1.0～5.9之間，再進行WB確證。另外，結合本州實際情況，對3類人群(孕產婦、兒童、婚檢)無論其ELISA結果如何均用WB確證，對HIV抗體不確定者隨訪，分析3個月后WB條帶情況。

1.4 判斷標準

根據《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》(2009年修訂版)要求，至少有2條包膜(env)糖蛋白(gp41和gp160/gp120)出現，或至少1條env帶和1條核心(gag)蛋白(p24)同時出現，才判定為HIV-1抗體陽性。

2 結果

2.1 WB檢測結果

2008～2011年共有2 452份樣本送往德宏州疾病預防控制中心艾滋病確證實驗室進行WB檢測，其中確認HIV陽性2 231例(90.99%)、陰性172例(7.01%)、不確定49例(2.00%)(表1)。

2.2 HIV抗體不確定者的人群分布及隨訪復檢情況

在 HIV抗體不確定受檢者中，以VCT、門診患者、參與項目調查者等一般人群居多，共29例，占59.18%(29/49)。對其中27例成功進行了隨訪復檢，有8例HIV抗體復檢轉為陽性，轉陽率為29.63%(8/27)，具體人群構成及復檢情況見表2、表3。

表1WB陽性、陰性和不確定在WB檢測總數中所占比例(n, %)

Tab.1Thepercentageofpositive,negativeandindeterminatesamples(n, %)

YearCasePositiveNegativeIndeterminate2008568522 (91.90)33 (5.81)13 (2.29)2009624565 (90.54)49 (7.85)10 (1.60)2010625561 (89.76)51 (8.16)13 (2.08)2011635583 (91.81)39 (6.14)13 (2.05)Total2 4522 231 (90.99)172 (7.01)49 (2.00)

表2HIV抗體不確定受檢人群分布及復檢情況

Tab.2ThepopulationdistributionofindeterminateHIVantibodyandcallbackcondition

PopulationSubjectCallback (positive)Voluntary counseling and testing137 (2)Outpatient94 (3)Study investigator77 (1)Drug user63 (1)Pregnant woman 51 (0)Premarital check-up42 (1)Employee physical examination33 (0)Spouse of HIV-infected patient10 (0)Monitoring site10(0)Total4927(8)

2.3 HIV抗體不確定者樣本的ELISA檢測結果

49例WB檢測結果為不確定的樣本中，48例進行ELISA檢測，結果如表4所示。S/CO值從低到高都有分布，但隨訪的27例不確定標本復檢陽性者S/CO值≥10的比例較高，為83.33%(5/6)，S/CO值<6的復檢陽性率僅為16.67%(3/18)。

表38份HIV抗體轉陽樣品的隨訪情況

Tab.3Thefollow-upof8sampleswithpositiveconversion

SampleInitial WB bandFollow-up ofWB bandInterval time of follow-up (d)1p24p24, gp1601552gp160p24, gp160183gp160p17, p24, p31, gp41, p51, p55, p66, gp120, gp160634gp160p24, p31, p66, gp120435gp160p24, p31, p66, gp1202056gp160p17, p24, p39, gp120, gp160357gp160p17, p24, p31, gp41448gp160p17, p24, p31, p39, gp41217

表448份HIV抗體不確定樣品的ELISA檢測結果

Tab.4TheELISAresultsof48indeterminatesamples

S/COSubject Result of callbackCallback Positive0-0.93101.0-1.98402.0-2.96513.0-3.97514.0-4.91105.0-5.92216.0-9.9830≥10.01365Total48278

2.4 HIV抗體不確定者樣本的WB條帶分布情況及復檢結果

在49例WB檢測結果為不確定的標本中，出現p24帶的標本最多，共21例，占42.86%；其中只有8.33%(1/12)在隨訪檢測中是陽性結果。其次是gp160帶，共16例，占32.65%；隨訪到10例，70.00%轉陽(7/10)(表5)。WB代表性帶型分布及對照見圖1。

表549份HIV抗體不確定標本的WB條帶分布情況

Tab.5ThedistributionofWBbandsof49indeterminatesamples

BandNumberFollow-up resultPositive Negative Percentage of conversionPositive conversion (%)Negative conversion (%)p24211118.3391.67gp160167370.0030.00p171010100p17, p242010100p17, gp1602010100p24, gp411010100gp12010000gp120, gp16010000p17, p511010100p24, p3910000p24, p51, p6610000p24, p6610000Total4981929.6370.37

SPC, strong positive control; WPC, weak positive control; NC, negative control. The bands from the fourth line to the bottom are indeterminate WB samples.

圖1HIV抗體不確定標本的WB條帶分布圖

Fig.1ThedistributionofWBbandsofindeterminatesamples

3 討論

2008～2011年德宏州WB檢測發(fā)現HIV抗體不確定者49例，占總檢測數的2.00%，且每年的檢測比例保持在穩(wěn)定水平，低于國內其他地區(qū)[3]。這可能是由于德宏州作為HIV高流行地區(qū)，對高危人群采用替代檢測策略進行確證，對達不到替代策略判定陽性標準的樣本采用WB確證，排除了部分易導致WB假陽性和不確定結果的樣本；同時說明德宏州對HIV篩查過程的質量控制較好，一定程度上為WB檢測質量提供了有力保證。

但研究發(fā)現，替代檢測策略有其限制性。如表4所示，S/CO值<6.0的標本，隨訪到的18例中有3例轉陽，陽性率達16.67%。而對S/CO≥6.0的9例隨訪發(fā)現，仍有4份樣本WB確證為陰性，陰性率也達44.44%。雖然這部分受試者屬重點觀察對象(孕產婦、兒童、婚檢)，但在對孕產婦、兒童、婚檢以外人群S/CO值≥6.0的樣本進行WB抽檢過程中也發(fā)現了類似現象。提示在對HIV感染與艾滋病病理診斷中，應對所有初篩陽性標本做確證試驗或進行病毒載量等輔助檢測。

對49例HIV抗體不確定者的人群與條帶分布研究表明，不確定人群中以相對健康的VCT和門診患者居多，也有IDU和感染者配偶等重點人群，說明導致HIV抗體不確定的原因是多種多樣的。HIV早期感染可能會導致不確定結果，自身非特異性抗體的存在、疫苗接種引起的假陽性、其他疾病(惡性腫瘤、自身免疫性疾病、其他病毒感染)和特殊生理狀況(過敏體質、懷孕等)均可能引起WB非特異性條帶出現。

非特異性條帶中，以p24出現的比例最高，高達42.86%；其次為gp160，占32.65%，與國內外報道一致[4,5]。對27例不確定者標本WB帶型的隨訪分析發(fā)現，出現p24條帶的標本有91.67%轉陰，而出現gp160帶的10例標本70.00%轉陽。由此可見，p24是一種非特異性抗體，在HIV感染者的血清轉換期出現的概率較高，在HIV早期感染檢測中有非常重要的意義。但是，p24具有非特異性，這是造成WB結果不確定的重要原因。出現gp160條帶的HIV抗體不確定者復檢陽轉率較高，與既往部分報道不一致[6]，需引起高度重視。在單獨gp160條帶出現時，注意復檢或結合其他檢測方法如病毒載量測定等進行診斷。另外，為避免窗口期等因素影響，根據《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》的要求，對HIV抗體不確定者，每3個月隨訪復檢1次，連續(xù)2次，共6個月。結合實驗室和患者情況，應縮短隨訪檢測時間，可在2周左右通知不確定者進行第1次隨訪，以求早日確診。

雖然WB是當前血清學篩查HIV抗體的常用方法之一，但HIV抗體篩查試驗存在的假陽性反應不容忽視。除受檢者自身生理病理狀況[7]外，還有以下原因：①樣本采集、運輸、處理和儲存中，任何一個過程如果質量控制不合格，就可能導致樣品溶血、污染、凝集不全或分離不全造成纖維蛋白原殘留，從而出現假陽性[8]；②一些傳染病可能有與HIV交叉反應的抗原[9,10]；③ELISA和快速初篩試驗的質量控制不嚴格，也會導致WB檢測假陽性率增加。

艾滋病檢測技術在不斷發(fā)展，HIV篩查試劑的敏感度在逐步提高，WB檢測也具備比以前更高的特異度。但在實際工作中，即使嚴格控制檢測質量，仍會出現WB檢測結果不能確定。國際上對WB結果的判定也存在一定爭議[11]。因此，對HIV抗體不確定的受檢者，應結合流行病學調查結果和臨床癥狀進行判斷。有條件的實驗室，還可縮短隨訪檢測時間，對WB隨訪檢測仍不確定的樣本，可考慮同時進行CD4細胞計數和HIV病毒載量檢測，爭取盡早確診，對感染者及時給予干預治療；對非感染者，也可去除其心理壓力。

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