閆飚 孫敬武 鄒嘉平 張磊

創(chuàng)傷性聲門關(guān)閉不全多指多種原因引起的聲帶麻痹或聲帶外傷疤痕形成后， 聲帶體積減小，聲門閉合不全，導(dǎo)致聲音嘶啞、呼吸困難、發(fā)音無力及誤咽等[1]，如果不及時治療可能導(dǎo)致聲帶及甲杓肌萎縮，文獻(xiàn)報道這類聲帶運動障礙如果三個月不能恢復(fù)正常，自愈的可能性不大，應(yīng)視為手術(shù)適應(yīng)癥[2]。自體組織聲帶注射是近年常用的治療聲門閉合不全的有效方法。骨骼肌成肌細(xì)胞是干細(xì)胞的一種，位于成人肌肉表面，以衛(wèi)星細(xì)胞存在[3]，又稱為衛(wèi)星細(xì)胞，具有其他干細(xì)胞所具有的基本特征。近年來成肌細(xì)胞移植己由實驗階段[4～6]初步走向臨床應(yīng)用，移植途徑主要為直接注射[7，8]。最近有學(xué)者[9，10]用帶有熒光標(biāo)記的成肌細(xì)胞注入去神經(jīng)支配的聲帶肌，結(jié)果注入的成肌細(xì)胞活性增加且與去神經(jīng)的肌纖維廣泛融合。本研究擬通過甲杓肌注射自體成肌細(xì)胞治療一側(cè)聲帶失去喉返神經(jīng)支配且疤痕萎縮致聲門閉合不全的實驗研究，觀察萎縮的聲帶容積及甲杓肌直徑的變化，探討其對創(chuàng)傷性聲門關(guān)閉不全的療效。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 20只成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體重1.5～2.0 kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

主要試劑及儀器：D-BPS 、DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司)，bFGF(美國GIBCO 公司), 胎牛血清(Hylcone公司)，透明質(zhì)酸酶，鏈酶蛋白酶，胰蛋白酶( Sigma公司) ，一抗：Rabbit anti-Desmin， Rabbit anti-SMA(博奧森)，SABC試劑盒，DAB顯色試劑盒(Zymed)。顯微鏡CX-40 (日本 Olympus公司)圖象分析系統(tǒng)Motic image advanced(3.2北京)。

1.2創(chuàng)傷性聲門閉合不全動物模型的建立 20只動物均在無菌條件下于第2～4氣管環(huán)水平切除左側(cè)喉返神經(jīng)1 cm，近心端結(jié)扎并縫于皮下，同時取出左側(cè)胸鎖乳突肌(供成肌細(xì)胞培養(yǎng)用)縫合切口；再在直達(dá)喉鏡下，暴露聲門，細(xì)鉤針于左側(cè)聲帶表面劃痕，深度達(dá)聲帶肌層，制成創(chuàng)傷性聲門關(guān)閉不全的模型。

1.3骨骼肌成肌細(xì)胞混懸液的制作 將取出的實驗兔左側(cè)胸鎖乳突肌，轉(zhuǎn)入超凈臺，采用兩步消化法和非連續(xù)密度梯度離心法分離及純化成肌細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。按SABC試劑盒說明書的方法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)蛋白免疫組化染色。

1.4骨骼肌成肌細(xì)胞注射 建立動物模型12周后，20只大白兔隨機(jī)分成A、B兩組，每組10只，細(xì)胞移植前兩組動物均連續(xù)1周腹腔注射免疫抑制劑環(huán)孢菌素A 50 mg·kg-1·d-1。動物以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，支撐喉鏡暴露聲門，顯微鏡下以喉顯微注射器將成肌細(xì)胞混懸液(0.3 ml)注射于A組兔左側(cè)萎縮聲帶中部及聲帶突旁甲杓肌內(nèi)(注射時稍過量，使矯正的聲帶越過中線，聲帶游離緣擴(kuò)散成一光滑輪廓)，B組同法于左側(cè)聲帶注射等量的生理鹽水。注射完畢后兩組動物均腹腔注射1周環(huán)孢菌素A50 mg·kg-1·d-1。兩組動物均以右側(cè)聲帶為正常對照。注射12周后觀察兩組動物雙側(cè)甲杓肌纖維直徑和對應(yīng)聲帶體積。

1.5甲杓肌組織形態(tài)學(xué)觀察 自體成肌細(xì)胞注射殺死實驗兔，取出雙側(cè)甲杓肌，行橫、縱切面切片，片厚4 μm，常規(guī)行HE染色及免疫組化染色。于光鏡下分別觀察雙側(cè)甲杓肌肌纖維的大體形態(tài)，橫截面積，纖維數(shù)量及細(xì)胞核數(shù)的變化，肌原纖維、胞核的分布及形態(tài)變化等。用Motic image advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)測定標(biāo)本肌纖維橫截面積，每張切片中測量100個肌細(xì)胞的直徑，自動計算均數(shù)。

1.6聲帶體積的測量 切取動物雙側(cè)聲帶，吸去表面血液，放入一毫升注射器中，加入生理鹽水達(dá)到一毫升刻度，然后把這些生理鹽水注入到另一個一毫升注射器中，測得體積，一毫升減去所得的生理鹽水體積即為聲帶的體積。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。自體甲杓肌直徑和聲帶體積的變化用配對資料的t檢驗，組間甲杓肌直徑和聲帶體積的比較用獨立樣本資料的t檢驗。

2 結(jié)果

20只大白兔在實驗過程中均無自然死亡。

2.1成肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)48小時后成肌細(xì)胞呈扁平狀,胞漿十分豐富,折光性強(qiáng)。4～5天后逐漸展現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)，早期細(xì)胞呈梭形或紡錘形，多為骨骼肌成肌細(xì)胞，隨細(xì)胞生長時間的延長，成肌細(xì)胞增殖且相互融合并逐漸沿一個方向平行排列，逐漸形成多核的肌管，且鋪滿瓶底。骨骼肌源性中間絲蛋白desmin在成肌細(xì)胞胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，胞質(zhì)染色呈棕色或棕黃色，成纖維細(xì)胞及其他雜質(zhì)細(xì)胞不著色(圖1)。

2.2甲杓肌組織形態(tài)學(xué)觀察 成肌細(xì)胞注射12周后可見兩組右側(cè)甲杓肌(正常對照側(cè))HE染色見肌纖維橫切面呈圓形或不規(guī)則多邊形，粗大，多核，肌纖維斷面呈細(xì)點狀，核位于肌膜邊緣；縱切面肌漿內(nèi)有許多與細(xì)胞長軸平行排列的肌原纖維，排列較整齊。正常對照側(cè)甲杓肌纖維平均直徑為72±10.43 μm。

B組左側(cè)甲杓肌嚴(yán)重萎縮，肌纖維形態(tài)散亂，大小各異，可見斷裂纖維相，核減少，可見核固縮深染或呈鏈狀排列，可見少量膠原纖維增生(圖2)。B組左側(cè)甲杓肌肌纖維平均直徑54±8.76 μm。

圖1 成肌細(xì)胞desmin表達(dá)(SABC×200)圖2 B組成肌細(xì)胞注射12周后甲杓肌橫截面HE染色(×200)圖3 B組成肌細(xì)胞注射12周后甲杓肌橫截面desmin表達(dá)(SABC×200)圖4 A組成肌細(xì)胞注射12周后甲杓肌橫截面desmin表達(dá)(SABC×200)

A組左側(cè)甲杓肌肌膜核排列漸整齊，呈鏈狀，核聚集減少，肌原纖維松散，肌纖維間界限不清。較正常對照組纖維結(jié)締組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤明顯，部分區(qū)域存在大量的混雜不清的細(xì)胞及膠原纖維，其中可見淋巴細(xì)胞、分葉狀核的中性細(xì)胞及毛細(xì)胞血管增多。A組左側(cè)甲杓肌肌纖維平均直徑72±11.60 μm。

2.3甲杓肌免疫組化染色鏡下觀察 B組左側(cè)甲杓肌縱切面肌纖維粗細(xì)不等，形狀不一，肌纖維明顯萎縮，排列不整齊，間距大小不等，肌纖維周圍成肌細(xì)胞較少；甲杓肌橫切面見肌纖維橫截面大多呈不規(guī)則型，大小不一，肌纖維間有的界限不清，甚至相互融合，肌纖維周圍成肌細(xì)胞較少，可見desmin表達(dá)較弱(圖3)；A組左側(cè)甲杓肌縱切面肌纖維粗細(xì)基本相等，形狀基本相同，肌纖維較粗，排列整齊，間距大小基本相等，肌纖維周圍成肌細(xì)胞較多；肌纖維橫截面積多呈圓形或長方形，粗細(xì)相差不大，肌纖維之間界限基本清楚，肌纖維周圍成肌細(xì)胞較多并且基本呈均勻分布，可見desmin表達(dá)較強(qiáng)(圖4)。

2.4聲帶體積和甲杓肌直徑測量結(jié)果 兩組聲帶體積測量結(jié)果見表1，甲杓肌直徑測量結(jié)果見表2，可見，A組聲帶體積和甲杓肌直徑均大于B組(P<0.05)，而與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。A組左側(cè)聲帶體積平均0.258±0.025 ml，B組平均0.221±0.0227 ml，正常對照側(cè)平均0.257±0.0156 ml。

表1 A、B兩組左側(cè)聲帶注射12周后及正常對照側(cè)的聲帶體積(ml)

注：與B組比較，t=3.4，P<0.05

表2 A、B兩組左側(cè)聲帶注射12周后及正常對照側(cè)甲杓肌纖維平均直徑

注：與B組比較，t=3.75，P<0.05

3 討論

骨骼肌受周圍神經(jīng)的支配，肌肉的長期運動及其結(jié)構(gòu)和功能的維持都依靠相應(yīng)運動神經(jīng)纖維的調(diào)節(jié)。Sunderlang[11]發(fā)現(xiàn)運動神經(jīng)元與骨骼肌細(xì)胞之間還存在其他復(fù)雜關(guān)系，這些關(guān)系是不依賴于神經(jīng)沖動的。肌細(xì)胞維持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)需要一些神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，如失神經(jīng)支配時，首先表現(xiàn)為肌纖維直徑和橫截面積的改變。既往研究[12]表明肌纖維橫截面積于失神經(jīng)2個月時下降70%，其后逐漸減緩，于4個月時下降80%，最終橫截面積可以減少80% ～ 90%。本研究切斷了實驗動物左側(cè)喉返神經(jīng)可使聲帶失神經(jīng)支配而萎縮，同時以銳器創(chuàng)傷同側(cè)聲帶使之疤痕形成后更加重了聲帶的萎縮，便于更好地觀察甲杓肌注射自體成肌細(xì)胞后對創(chuàng)傷性聲門閉合不全的治療效果。結(jié)果顯示，注射生理鹽水的B組術(shù)側(cè)甲杓肌的肌纖維直徑和聲帶體積較正常對照組明顯縮小，而注射自體成肌細(xì)胞的A組術(shù)側(cè)與健側(cè)及B組相比較，甲杓肌纖維直徑和聲帶體積等縮小不明顯，說明甲杓肌注射成肌細(xì)胞可以有效防治其肌肉萎縮。

一般情況下成肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，一旦肌肉受創(chuàng)傷，成肌細(xì)胞即被激活，進(jìn)入有絲分裂周期，彼此融合且與受損的肌纖維融合以保持和恢復(fù)骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的完整。本研究中，A組左側(cè)甲杓肌和聲帶未發(fā)生明顯萎縮，可能與以下因素有關(guān)：①注射后的成肌細(xì)胞具有一定的移行潛能，成肌細(xì)胞可以存活并分化為骨骼肌肌纖維；②存活的成肌細(xì)胞可通過局部分泌細(xì)胞因子特別是生長因子刺激甲杓肌干細(xì)胞的產(chǎn)生和聲帶上皮細(xì)胞增生完成自身修復(fù)，產(chǎn)生更多的功能細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示自體成肌細(xì)胞的提取和體外增殖成功，說明制備自體成肌細(xì)胞切實可行。自體成肌細(xì)胞注射12周后甲杓肌肌纖維周圍成肌細(xì)胞明顯增多，說明注射的成肌細(xì)胞已成活并與宿主細(xì)胞很好的融合，一方面注射的成肌細(xì)胞使甲杓肌在失神經(jīng)支配時直徑增加，另一方面使疤痕攣縮的聲帶體積增加，可有效的治療聲門閉合不全。說明自體成肌細(xì)胞甲杓肌注射對創(chuàng)傷性聲門關(guān)閉不全的治療具有可行性，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

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