李永賀 李威 陳浩 吳劍 萬良財(cái)

鹽酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride,PPTA)是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成篩選出來的化學(xué)創(chuàng)新藥。研究表明鹽酸椒苯酮胺計(jì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，具有增強(qiáng)心臟功能并降低心肌耗氧量的雙重作用，它能增加收縮蛋白對Ca2+的敏感性，而不增加心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]超載，是鈣增敏劑類強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑[1]。目前，國內(nèi)外尚無鹽酸椒苯酮胺對內(nèi)耳缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究，本研究通過豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷造模，同時(shí)應(yīng)用PPTA，探討PPTA對內(nèi)耳缺血再灌注的保護(hù)作用及可能機(jī)制，以擴(kuò)大鹽酸椒苯酮胺的臨床適應(yīng)癥，為鹽酸椒苯酮胺用于缺血性內(nèi)耳疾病的治療提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 實(shí)驗(yàn)動物為健康純白紅目豚鼠32只，雌雄不拘，體重250～350 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物合格證編碼：4402101425)，所選豚鼠耳廓反射靈敏，鼓膜完整，標(biāo)志清楚，均經(jīng)ABR測試排除聽力異常者。動物隨機(jī)分為4組，每組8只，第1組為正常組(不做任何處理), 第2組為空白對照組(手術(shù)切開頸前正中皮膚，分離出雙側(cè)椎動脈、雙側(cè)頸總動脈，但不做其它處理), 第3組為缺血再灌注對照組(耳蝸缺血再灌注造模成功后，再灌注的同時(shí)股靜脈給予與PPTA同等劑量的生理鹽水), 第4組為缺血再灌注實(shí)驗(yàn)組(耳蝸缺血再灌注造模成功后，再灌注的同時(shí)靜脈給予PPTA 10 mg/kg)。本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建立右側(cè)耳蝸缺血再灌注動物模型 第3、4組動物進(jìn)行右側(cè)耳蝸缺血再灌注造模。動物以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位，頸前脫毛，碘伏消毒，做正中切口，逐層分離至氣管，正中分離氣管周圍組織，游離出兩側(cè)頸總動脈、椎動脈；向上繼續(xù)分離至右側(cè)聽泡，用耳科顯微電鉆磨開聽泡，暴露耳蝸，棉拭子拭去耳蝸底回外側(cè)壁的黏骨膜，三維固定儀固定激光多普勒血流儀探針型探頭于耳蝸底回外側(cè)壁，穩(wěn)定5分鐘后連續(xù)記錄耳蝸血流量(cochlear blood-flow,CoBF)，用無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)椎動脈及右側(cè)頸總動脈，連續(xù)記錄CoBF變化，CoBF不再下降并穩(wěn)定時(shí)即耳蝸缺血建模成功；耳蝸缺血60分鐘后，松開雙側(cè)椎動脈及右頸總動脈微動脈夾，連續(xù)觀察CoBF，至少達(dá)缺血前70%水平并保持穩(wěn)定后即耳蝸再灌注建模成功。

1.2.2ABR檢測 四組動物分別于實(shí)驗(yàn)前、缺血再灌注后24小時(shí)測量右耳ABR各波波間期及反應(yīng)閾。檢測在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，動物經(jīng)腹腔麻醉后，用短銀針(自制，極間阻抗<2 000 Ω)作電極，顱頂雙耳連線正中點(diǎn)為記錄電極，右耳后乳突皮下為參考電極，左耳后乳突皮下為接地電極，耳機(jī)離右外耳道口0.5 cm，左耳加低強(qiáng)度白噪聲(低于刺激聲20 dB SPL)掩蔽。用短聲(click)為刺激聲，由TDH-39P耳塞輸出，采樣重復(fù)頻率11.1次/s(刺激間隔90 ms)，交替起始位相以消除偽跡，濾波帶通100～3 000 Hz，疊加次數(shù)256～512次，分析時(shí)程20 ms，聲刺激重復(fù)率15 Hz，放大倍數(shù)100 000倍。測試時(shí)給聲強(qiáng)度由100 dB SPL開始，以5 dB SPL遞減誘發(fā)ABR波形，以能引出波Ⅲ的最小聲強(qiáng)記錄其反應(yīng)閾(統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)選擇刺激聲壓級90、60、30 dB SPL為記錄點(diǎn))。

1.2.3耳蝸掃描電鏡標(biāo)本及透射電鏡標(biāo)本制備 掃描電鏡標(biāo)本制備：各組造模成功24小時(shí)分別完成ABR測試后，每組取4只豚鼠斷頭取右側(cè)聽泡，于顯微鏡下用分離針取出鐙骨底板并挑破圓窗，沿耳蝸底回挑開蝸窗下緣骨壁，再在耳蝸頂部鉆一小孔，用配置好的0.01 M PBS緩沖液緩慢灌注，沖洗出內(nèi)、外淋巴液，將耳蝸組織浸入2%戊二醛固定液，在4 ℃冰箱內(nèi)固定12小時(shí)以上取出耳蝸組織，漂洗后自耳蝸底層逐層剝離蝸殼，完整暴露出內(nèi)耳膜迷路。經(jīng)鋨酸及漂洗后，將樣品依次浸入不同濃度的乙醇中，然后予純丙酮置換，轉(zhuǎn)入中間液醋酸異戊酯中，再將移至臨界點(diǎn)干燥儀的樣品室內(nèi)干燥，噴金后掃描電鏡下觀察標(biāo)本。 透射電鏡標(biāo)本制備：取各組剩余4只豚鼠，斷頭后迅速取右側(cè)聽泡，同掃描電鏡制備方法首先予戊二醛將耳蝸組織固定，0.1 M pH 7.4 PBS緩沖液反復(fù)沖洗后移入10% EDTA(PH7.4)中脫鈣7天，雙蒸水清洗標(biāo)本，按順序浸入不同濃度的乙醇中梯度脫水，然后再浸入不同濃度的丙酮中。環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，厚度50～70 nm。枸緣酸鉛染色，1%NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后透射電鏡觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件以協(xié)方差分析+配比樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α=0.05)。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)前后各組豚鼠的ABR反應(yīng)閾比較 實(shí)驗(yàn)前4組動物ABR波Ⅲ反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，缺血再灌注24 h后第3組ABR波Ⅲ反應(yīng)閾顯著高于第1組和第2組(P<0.05)，第4組ABR波Ⅲ反應(yīng)閾比第3組明顯降低(P<0.05)(表1)。

2.2耳蝸組織掃描電鏡觀察 掃描電鏡下觀察各組耳蝸第二回和底回，第1、2組內(nèi)、外毛細(xì)胞排列有序，細(xì)胞形態(tài)正常，無缺失，細(xì)胞間連接完整，可見外毛細(xì)胞靜纖毛成“W”型由低到高的整齊排列，內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛呈弓字形整齊排列，靜纖毛頂部有橫鏈相互聯(lián)系(圖1，2)；第3組耳蝸底回外毛細(xì)胞纖毛倒伏、脫落，部分外毛細(xì)胞融合成團(tuán)塊狀，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛散亂，呈團(tuán)狀改變(圖3)；第4組偶有外毛細(xì)胞纖毛倒伏、缺失、融合成束狀，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛排列規(guī)整、無缺失、倒伏，各層細(xì)胞形態(tài)清楚，未見明顯缺失、瘢痕形成(圖4)。

表1 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾比較

圖1第1組耳蝸底回掃描電鏡圖三排外毛細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞間連接完整，纖毛排列整齊，無倒伏、缺失

圖2第2組耳蝸底回掃描電鏡圖三排外毛細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，纖毛無倒伏、缺失，細(xì)胞形態(tài)正常

圖3第3組耳蝸底回掃描電鏡圖外毛細(xì)胞纖毛倒伏、脫落，部分外毛細(xì)胞融合成團(tuán)塊狀，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛散亂，呈團(tuán)狀改變

圖4第4組耳蝸底回掃描電鏡圖第一排外毛細(xì)胞纖毛倒伏、缺失、融合成束狀，第二、三排外毛細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞纖毛排列規(guī)整、無缺失、倒伏，各層細(xì)胞形態(tài)清楚，未見明顯缺失、瘢痕形成

2.3耳蝸組織透射電鏡觀察 第1、2組毛細(xì)胞細(xì)胞核呈圓形，邊界清晰，無固縮及邊集，線粒體無腫脹，分布均勻，突觸結(jié)構(gòu)完整(圖5，6)；第3組毛細(xì)胞細(xì)胞核膜溶解，邊界不清，線粒體腫脹、邊集，突觸結(jié)構(gòu)消失，可見纖毛缺失(圖7)；第4組毛細(xì)胞胞核圓，未見固縮、邊集，線粒體分布均勻，無明顯腫脹，突觸結(jié)構(gòu)尚清晰(圖8)。第3組動物耳蝸血管紋內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核固縮、邊集，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間有空泡形成，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞核輕度固縮、邊集，神經(jīng)元髓鞘可見脫髓鞘改變(圖9，10)。而第4組血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷輕于第3組(圖11，12)。

圖5第1組毛細(xì)胞透射電鏡圖細(xì)胞核呈圓形，邊界清晰，無固縮及邊集，線粒體無明顯腫脹，分布均勻，毛細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)完整

圖6第2組毛細(xì)胞透射電鏡圖細(xì)胞核呈圓形，無固縮及邊集，線粒體無明顯腫脹，分布均勻，突觸結(jié)構(gòu)完整

圖7第3組毛細(xì)胞透射電鏡圖細(xì)胞核膜溶解，邊界不清，線粒體腫脹、邊集，突觸結(jié)構(gòu)消失，可見纖毛缺失

圖8第4組毛細(xì)胞透射電鏡圖細(xì)胞核圓，未見固縮、邊集，線粒體分布均勻，無明顯腫脹，突觸結(jié)構(gòu)尚清晰

圖9第3組螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元透射電鏡圖像可見胞核輕度固縮、邊集，神經(jīng)元髓鞘可見大量脫髓鞘改變

圖10第3組血管紋血管內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡圖像可見細(xì)胞核固縮、邊集，血管呈充血改變，結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間有空泡形成

圖11第4組螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元透射電鏡圖像可見細(xì)胞核無固縮及邊集，神經(jīng)元髓鞘可見少量脫髓鞘改變

圖12第4組血管紋血管內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡圖像可見胞核核膜完整，無固縮、邊集現(xiàn)象

3 討論

目前，國內(nèi)外研究者建立了諸多不同的豚鼠耳蝸缺血再灌注模型[2～6]。為構(gòu)建豚鼠耳蝸缺血再灌注模型，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)如永久阻斷椎動脈不但易致動物死亡，而且不易保證足夠的血液再灌注流量，所以本實(shí)驗(yàn)時(shí)改良了永久結(jié)扎雙側(cè)椎動脈的方法，通過暫時(shí)性微動脈夾夾閉雙側(cè)椎動脈及右側(cè)頸總動脈60分鐘制造缺血模型，然后松開三條動脈制造再灌注模型，這樣既有效地形成耳蝸的缺血損傷，又能保證在復(fù)流后動物較高的存活率，從文中結(jié)果看，本研究采用的耳蝸缺血再灌注方法是可行的，且造模是成功的。

有研究指出缺血后再灌注造成的損傷大于單純?nèi)毖斐傻膿p傷[7]，缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是指缺血的組織、器官恢復(fù)血液灌注后不但不能使其結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，反而加重其結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的現(xiàn)象。

耳蝸對內(nèi)耳血流和氧供應(yīng)的降低或中斷極為敏感，缺血再灌注損傷導(dǎo)致內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和功能改變的機(jī)制復(fù)雜，可能與鈣超載和炎癥介質(zhì)的釋放等有關(guān)。當(dāng)耳蝸發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，耳蝸細(xì)胞內(nèi)Na+/Ca2+交換異常，細(xì)胞內(nèi)鈣離子迅速增加；鈣離子超載可使細(xì)胞膜受損、破裂，線粒體損傷抑制氧化磷酸化過程，ATP 生成減少，同時(shí)耳蝸內(nèi)氧自由基生成增多[8]，破壞包膜，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死；鈣超載、氧自由基增多可使生物膜受損，細(xì)胞腫脹，線粒體功能受損，能量生成減少，耳蝸無能量供應(yīng)。興奮性中毒損傷螺旋神經(jīng)節(jié)，導(dǎo)致傳入神經(jīng)纖維腫脹[9]，聽覺傳導(dǎo)通路受阻，發(fā)生聽力障礙。從文中結(jié)果看，第3組動物因耳蝸缺血再灌注使其耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生脫髓鞘改變，缺血再灌注后因多種機(jī)制相互作用，導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞腫脹、破裂，細(xì)胞凋亡、壞死；該組動物ABR反應(yīng)閾明顯較實(shí)驗(yàn)前及其他各組升高，與Alonso的研究結(jié)果相似[10]。研究表明PPTA{(E)-5-[(3,4-亞甲二氧基苯乙基)甲氨基]-1-(4)-羥基苯基-1-戊烯-3-酮鹽酸鹽；分子式C21H24O4NCl}可能通過改善腦缺血再灌注損傷后引起的炎癥及凋亡反應(yīng)，增加腦組織對缺血再灌注損傷應(yīng)激的耐受性，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在對局灶性腦缺血再灌注損傷的研究中，PPTA可能通過抑制脂質(zhì)過氧反應(yīng)和清除自由基等機(jī)制，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11，12]。本研究第4組豚鼠經(jīng)早期使用PPTA，其ABR反應(yīng)閾雖較正常組升高，但明顯低于第3組(即缺血再灌注對照組),表明PPTA對再灌注后耳蝸功能有保護(hù)作用，可能在缺血再灌注的早期PPTA發(fā)揮了抗鈣超載的作用，減輕了鈣超載引起的細(xì)胞損傷，同時(shí)有可能減少了自由基的釋放，從而減輕線粒體損傷，保護(hù)了毛細(xì)胞的功能。

Tabuchi等[13]認(rèn)為在缺血15分鐘和30分鐘，分別可以觀察到耳蝸外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞腫脹，隨著缺血時(shí)間延長，細(xì)胞會發(fā)生核溶解，細(xì)胞膜斷裂，柯蒂器崩解，毛細(xì)胞缺損，血管紋出現(xiàn)水腫變性，繼而崩解；Watanabe等[14]認(rèn)為外毛細(xì)胞更易耐受缺血損傷。從本研究結(jié)果可見，豚鼠耳蝸缺血再灌注后外毛細(xì)胞形態(tài)破壞，部分缺失，細(xì)胞間連接破壞，靜纖毛倒伏、脫落、缺失或融合成束狀，第一、二排尤為明顯，底回比其它各回明顯，內(nèi)毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，與Watanabe等[14]與所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果有所不同；另外，透射電鏡下可見第3組毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋血管內(nèi)皮細(xì)胞的病變明顯較第4組嚴(yán)重，可能PPTA通過清除耳蝸組織的氧自由基、對抗鈣超載等機(jī)制抑制了缺血再灌注對耳蝸組織帶來的損害，能快速而有效的治療缺血再灌注對耳蝸造成的損傷；但由于缺血損傷會部分造成耳蝸功能的不可逆損害，掃描電鏡觀察第4組仍有毛細(xì)胞缺失，說明再灌注時(shí)雖應(yīng)用了PPTA，但并不能改善這部分損傷，故該組動物ABR反應(yīng)閾雖較第3組低，但仍較實(shí)驗(yàn)前升高。

綜上所述，缺血再灌注早期應(yīng)用PPTA對豚鼠耳蝸的缺血再灌注導(dǎo)致的聽功能損傷有保護(hù)作用，但PPTA對抗耳蝸缺血再灌注損傷的具體機(jī)制，以及給藥的最佳時(shí)機(jī)與劑量需要進(jìn)一步探索。

4 參考文獻(xiàn)

1 賓娟，王茜，卓燁燁，等.椒苯酮胺對全腦缺血/再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J].中國新藥雜志，2012，21：366.

2 Okada M, Kawaguchi AT, Hakuba N, et al.Liposome-encapsulated hemoglobin alleviates hearing loss after transient cochlear ischemia and reperfusion in the gerbil[J].Artif Organs，2012,36:178.

3 張學(xué)淵, 汪吉寶. 光化學(xué)建立豚鼠耳蝸微循環(huán)障礙模型的初步報(bào)告[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 1995, 30:285.

4 Hakuba N, Matsubara A, Hyodo J,et al.AMPA/kainate-type glutamate receptor antagonist reduces progressive inner hair cell loss after transient cochlear ischemia[J]. Brain Res，2003,979:194.

5 Tabuchi K, Ito Z, Wada T, et al．Effect of 7-nitroindazole upon cochlear dysfuction induced by transient local anoxia[J]．Ann Otol Rhino Laryngol,2000,109:715.

6 Tabuchi K, Ito Z, Tsuji S, et a.．Poly(adenosine diphosphate-ribose) synthetase inhibitor 3-aminobenzamide alleviates cochlear dysfuction induced by transient ischemia[J]．Ann Otol Rhino Laryngol,2001,110:118.

7 Nakashima T, Naganawa S, Sone M, et al. Disorders of cochlear blood flow[J] . Brain Research Reviews, 2003, 43: 17.

8 Morizane I, Hakuba N, Hyodo J, et al. Ischemic damage increases nitric oxide production via inducible nitric oxide synthase in the cochlea[J]. Neurosci Lett,2005,391:62.

9 Puel JL, Pujol R, Tribillac F, et al. Excitatory amino acid antagonists protect cochlear auditory neurons from excitotoxicity[J]. J Comp Neurol,1994,341:241.

11 朱漢祎,賓娟,王闖，等,椒苯酮胺對缺血再灌注大鼠認(rèn)識障礙的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011，31: 1 858.

12 朱漢祎,林煥冰,陳玉嬪，等,椒苯酮胺對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[ J]. 軍事醫(yī)學(xué),2011,35:286.

13 Tabuchi K,Tsuji S, Fujihira K,et al. Outer hair cells functionally and structurally deteriorate during reperfusion[J]. Hear Res,2002,173:153.

14 Watanabe F, Hakuba N, Gyo K.Measurement of DPOAE after ischemia/reperfusion injury of the cochlea in gerbils. Neurosci Lett,2009,467:135.