陳觀貴 徐亞麗 毛敏 丘理子

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一種存在于細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子滲透壓的蛋白通道，對(duì)于包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的各種組織細(xì)胞的水和電解質(zhì)平衡起到關(guān)鍵作用。在腦水腫、神經(jīng)炎、青光眼、癲癇、腫瘤、疼痛、肥胖、梅尼埃病等疾病治療中有良好的前景[1，2]。 目前已在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)13種AQP亞型，即AQP 0～12，其中AQP1～7和AQP 9表達(dá)于內(nèi)耳[1，3]。氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)具耳毒性、腎毒性等副作用，但AmAn 的致聾機(jī)制仍未完全闡明。研究證明AmAn 可以下調(diào)腎組織AQP的表達(dá)從而導(dǎo)致腎濃縮功能下降[4]，為了解AmAn是否也會(huì)影響內(nèi)耳AQP4 的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致聽力損失，本研究擬通過對(duì)小鼠皮下注射阿米卡星后，檢測其內(nèi)耳AQP4蛋白及基因的表達(dá)變化，探討AQP4在阿米卡星耳毒性機(jī)制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 60只CBA/CaJ 小鼠，體重200～250 g，檢查外耳道通暢，鼓膜標(biāo)志正常，對(duì)聲刺激反應(yīng)靈敏。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(皮下注射阿米卡星)和對(duì)照組(皮下注射等量生理鹽水)，每組30只，其中各組用于耳蝸切片免疫組化檢測6只， Westen Blots檢測12只、RT-PCR檢測12只。

1.2阿米卡星耳毒性模型的建立 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)建立的耳毒性模型[5]，采用阿米卡星皮下注射，450 mg/kg，每天1次，共14 d。對(duì)照組動(dòng)物皮下注射等量重理鹽水。注射前和注射14 d后均行雙耳ABR檢測，證實(shí)致聾效果。于第二次行ABR檢測后即取耳蝸標(biāo)本。

1.3耳蝸切片制備及免疫組織化學(xué)染色 動(dòng)物以1%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射深度麻醉，解剖暴露心臟，依次用4 ℃生理鹽水、4 ℃固定液(4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，pH=7.4)灌流。快速斷頭，取出雙側(cè)聽泡， 冰浴下解剖耳蝸組織，固定液中4 ℃過夜。放入10% EDTA鈉溶液(pH=7.4)中脫鈣14 d。石蠟包埋，取蝸軸平行切面連續(xù)切片，片厚約5 μm。耳蝸中軸切片，行免疫組織化學(xué)染色[5]，觀察小鼠內(nèi)耳AQP4的表達(dá)，棕黃色為陽性表達(dá)細(xì)胞。

1.4Western Blot檢測AQP4蛋白表達(dá) 小鼠麻醉后剪開右心耳流出血液，快速斷頭并打開聽泡，置入PBS溶液中，冰浴下在解剖顯微鏡下分離耳蝸組織(以每只動(dòng)物的雙耳為一個(gè)計(jì)量單元)，冰浴裂解組織后，13 000 rpm，40 ℃離心10 min，取上清，測定蛋白濃度。用 10 %的SDS-PAGE分離膠電泳，將蛋白分離產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，添加多克隆AQP4抗體(Chemicon公司，美國)，4 ℃過夜，添加二抗(羊抗兔 IgG-HRP，santa cruz，美國)室溫下溫育90 min，用ECL系統(tǒng)顯色曝光。以β-actin 為對(duì)照。

1.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測AQP4 mRNA表達(dá) 小鼠過量麻醉致死，70%酒精浸濕動(dòng)物全身毛發(fā)，斷頭，冰浴下解剖聽泡取出內(nèi)耳組織(以每只動(dòng)物的雙耳為一個(gè)計(jì)量單元)。提取總RNA，按照一步式逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (QIAGEN公司，美國) 說明進(jìn)行RT-PCR，以β- act in 為內(nèi)參照。 反應(yīng)條件：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃初始激活15 min，94 ℃變性50 s, 60 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s, 35次循環(huán)，72 ℃最后延長10 min。AQP4引物上游序列為 5’-ATGGTGGCTTTCAAAGGGGT-3’，下游序列為5’GATGGGCCCAACCCAATATAT-3′，擴(kuò)增片段長度為610 bp； B-actin 引物上游序列為 5’-ATCCTGCGTCT GGACCTGG- 3’，下游序列為5’-TAGGCATTTCTGGAGAT-3’，擴(kuò)增片段長度為 365 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上成像記錄。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Western Blot及RT-PCR電泳圖像結(jié)果采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析，分別用目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的平均灰度值比值作為產(chǎn)物相對(duì)含量。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組阿米卡星致聾情況 實(shí)驗(yàn)組小鼠注射阿米卡星14 d后，ABR反應(yīng)閾均大于75 dB SPL，證明達(dá)到藥物致聾效果。注射過程中沒有小鼠死亡。

2.2AQP4在內(nèi)耳的表達(dá)定位 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組耳蝸組織切片中均見AQP4陽性表達(dá)細(xì)胞位于Corti器的支持細(xì)胞(Hansen細(xì)胞、Claudius細(xì)胞等)，而蝸軸螺旋神經(jīng)節(jié)、耳蝸外側(cè)壁等部位均未見陽性染色細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組的陽性染色較對(duì)照組弱(圖1)。

圖1 對(duì)照組(a)和實(shí)驗(yàn)組(b)小鼠耳蝸AQP4的表達(dá) (免疫組化×200)

2.3兩組小鼠耳蝸AQP4蛋白及mRNA的表達(dá)量 Western Blot檢測顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均顯示30 kDa處有陽性目標(biāo)條帶，β-actin為內(nèi)參蛋白(40 kDa)(圖2)；RT-PCR檢測顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均顯示610 bp處有陽性目標(biāo)產(chǎn)物， β-actin為內(nèi)參基因(365 bp)(圖3)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AQP4蛋白相對(duì)含量分別為0.672±0.074和0.479±0.108，對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.120，P<0.01)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的AQP4 mRNA相對(duì)含量分別為0.701±0.107和0.460±0.080，對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.232，P<0.01)。

圖2 Western Blot檢測小鼠耳蝸AQP4蛋白表達(dá)

1為對(duì)照組，2為實(shí)驗(yàn)組，30 kDa處有陽性目標(biāo)條帶AQP4，β-actin為內(nèi)參蛋白(40 kDa)

圖3 RT-PCR檢測小鼠耳蝸AQP4表達(dá)

1為marker，2為對(duì)照組，3為實(shí)驗(yàn)組，610 bp處有AQP4陽性目標(biāo)產(chǎn)物，β-actin為內(nèi)參蛋白(365 bp)

3 討論

AQP4是AQP家族中影響水通透性最高的蛋白，在小鼠及大鼠內(nèi)耳表達(dá)的部位非常相似，主要定位于Hensen細(xì)胞的基側(cè)質(zhì)膜、Claudius細(xì)胞和內(nèi)溝細(xì)胞的基底側(cè)質(zhì)膜，前庭部分的斑和嵴、耳蝸神經(jīng)、前庭神經(jīng)的中樞部上皮也有AQP4[6,7]。此外，大鼠和小鼠的前庭感受器周圍的支持上皮、聽神經(jīng)周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有AQP4表達(dá)[8]。從本研究結(jié)果看， AQP4在小鼠內(nèi)耳中主要定位于Corti器的支持細(xì)胞，蝸軸螺旋神經(jīng)節(jié)、耳蝸外側(cè)壁等部位均未見陽性染色細(xì)胞。人體標(biāo)本的免疫組化染色表明AQP4表達(dá)于外溝細(xì)胞、Hensen細(xì)胞、Claudius細(xì)胞、前庭支持細(xì)胞及內(nèi)淋巴囊上皮[9～11]。AQP4在內(nèi)耳組織的表達(dá)定位提示其可能參與維持內(nèi)耳感覺上皮的水滲透平衡，并且種屬間AQP4表達(dá)的相似性和調(diào)節(jié)序列的保守性提示AQP4在內(nèi)耳的功能高度保守和穩(wěn)定作用。

AQP4的正常表達(dá)是維持聽功能所必須的。在基因敲除物模型研究中，目前已有AQP1、3、4、5 亞型的敲基因小鼠模型，其中只有 AQP4 敲基因小鼠有聽力損失[6，8，12]。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏 AQP4 的CD1 基因背景小鼠ABR反應(yīng)閾顯著增高，聽力減退呈現(xiàn)出頻率依賴性，但光鏡下耳蝸形態(tài)學(xué)未見任何異常[6]。Nicchia[13]發(fā)現(xiàn)人類基因中D184E點(diǎn)突變可導(dǎo)致AQP4通透性改變從而導(dǎo)致聽力損失。另外，AQP4 可能與老年性聾有關(guān)，Christensen等[14]研究老年性聾小鼠耳蝸及下丘腦的AQP4 變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，耳蝸AQP4基因的表達(dá)下調(diào)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)耳AQP4表達(dá)明顯低于對(duì)照組，但其表達(dá)異常未導(dǎo)致內(nèi)耳形態(tài)學(xué)的改變，而導(dǎo)致小鼠ABR反應(yīng)閾提高，故推測其導(dǎo)致聽力損失最可能的原因是改變了內(nèi)耳細(xì)胞內(nèi)水循環(huán)及離子濃度梯度的穩(wěn)定，從而影響毛細(xì)胞、支持細(xì)胞的功能以及聽神經(jīng)通路的傳達(dá)性能。

多種因素參與AQP 的調(diào)節(jié)，包括類固醇激素、抗利尿激素、水潴留、腎上腺鹽皮質(zhì)激素、細(xì)胞因子、病理生理狀態(tài)等，同時(shí)某些藥物也可以通過影響AQP的表達(dá)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。AmAn、化療藥、利尿藥等藥物的耳毒性是臨床常見問題，藥物性聾仍是我國聾兒的重要致病原因；關(guān)于AmAn 耳毒性機(jī)制存在各種理論，如膜功能受損、藥物在內(nèi)耳的高濃度蓄積、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制破壞、細(xì)胞代謝抑制、氧自由基損傷等，目前認(rèn)為是多種機(jī)制所致。Lee等[4]研究慶大霉素導(dǎo)致腎濃縮功能障礙的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)慶大霉素可以明顯減少大鼠腎內(nèi)AQP2 蛋白的表達(dá)，高濃度時(shí)還會(huì)影響AQP1 和AQP3 的表達(dá)，順鉑[15，16]、兩性霉素B[17]導(dǎo)致的腎毒性中AQP也有類似的改變。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組AQP4的蛋白及mRNA的表達(dá)均低于對(duì)照組，提示阿米卡星可導(dǎo)致小鼠內(nèi)耳AQP4表達(dá)的下調(diào)，這可能是阿米卡星耳毒性的機(jī)制之一，同時(shí)也提示AmAn類藥物的腎毒性及耳毒性可能存在相似的分子作用機(jī)制，值得深入研究。

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