李福榮 胡月華 張 偉 韓俊芬 游桂榮 邢酈健

(1.泰山醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室，山東 泰安 271016；2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

泰山照山白為杜鵑花科植物照山白(Rhododendrom micranthum Turcz)的枝葉。其中含有各種黃酮類成分如金絲桃苷及多種皂苷、鞣質(zhì)、油脂和揮發(fā)油等, 傳統(tǒng)用于祛痰止咳及活血通絡(luò)等, 有研究顯示其浸膏不僅具有平喘、解痙等作用[1-2]，還對(duì)舒張動(dòng)脈平滑肌、降低實(shí)驗(yàn)性高血壓發(fā)揮一定的作用。但是泰山照山白總黃酮對(duì)于氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料 神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12購于中科院生化細(xì)胞所。兔抗人caspase-3多克隆抗體、TNFα、IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。二甲基亞砜(DMSO)為北京化工廠產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司；MTT購自Sigma公司；胰蛋白酶-EDTA消化液購自北京Solarbio科技有限公司。

1.1.2照山白提取物(RME)的制備 取夏末采收泰山照山白藥材250 g, 加入8倍量75%乙醇浸泡過夜, 加熱回流提取, 真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作合并濾液，50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，洗脫所含木毒素，濃縮蒸干即得RME浸膏58 g 。用80%乙醇定容至10mL，微孔濾膜過濾除菌，存于4 ℃冰箱。

1.1.3細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將PC12細(xì)胞株置于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)，以10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，接種于25 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。細(xì)胞生長至融合率達(dá)70%～80%時(shí)，無血清培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步化于G0期，加RME進(jìn)行預(yù)處理24 h。分組如下：正常對(duì)照組：僅加入DMEM培養(yǎng)基；損傷組：H2O2(150 μmol·L-1)；RME低、中、高劑量預(yù)處理組: (10、 20、50 μg·L-1)，預(yù)處理后加入H2O2作用12 h。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞, 制成1×105/ml的細(xì)胞懸液, 接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100 μl培養(yǎng)過夜，PBS洗滌，按照上述分組處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h后, 加入MTT溶液( 5mg/ml) 10 μl培養(yǎng)4 h, 棄去各孔內(nèi)液體, 加入100 μl二甲基亞砜，振蕩器振蕩5 min, 室溫放置10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A490 nm值，取3孔平均值計(jì)算細(xì)胞抑制率:抑制率%=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值) ×100%。

1.2.2ELISA 法檢測(cè)上清TNFα、IL-1β含量 細(xì)胞分組以及處理同上，收集各分組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA 法檢測(cè)TNFα、IL-1β的產(chǎn)生量，操作按試劑盒說明進(jìn)行，酶標(biāo)儀 450 nm 處測(cè)定 A 值。

1.2.3免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè) caspase-3 的表達(dá) 調(diào)整 PC12 細(xì)胞密度為 1×106/ml ，制作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)于6孔板內(nèi), 待細(xì)胞貼壁過夜后加入無血清 RPMI-1640 培養(yǎng)液12 h, 使細(xì)胞同步化。加入三個(gè)濃度的RME預(yù)處理 12 h 后, 加入H2O2(150 μmol·L-1) 損傷 12 h，加入caspase-3一抗孵育, 4 ℃過夜， PBS洗滌3 次，加入二抗孵育2h， PBS沖洗, 磷酸甘油緩沖液封片，免疫熒光顯微鏡觀察。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1RME對(duì)損傷PC12 細(xì)胞存活率的影響 與空白對(duì)照組相比, H2O2模型組的細(xì)胞存活率明顯降低( 63.72%，P<0.01)； 經(jīng)RME預(yù)處理后，細(xì)胞存活率升高為73.71% 、82.76% 和 89.27%，與H2O2損傷組比較, 差異顯著(P<0.05,P<0.01)。見圖 1。

圖1 MTT檢測(cè)RME對(duì)細(xì)胞活性的影響

注：*P<0.01vs對(duì)照組，#P<0.05vs損傷組，##P<0.01vs損傷組

A: 正常對(duì)照組; B: 損傷組; C: 10 μg·L-1RME; D: 20 μg·L-1RME; E: 50 μg·L-1RME

2.2RME對(duì)培養(yǎng)液上清TNFα、IL-1β含量的影響 TNFα、IL-1β等炎性細(xì)胞因子是引起慢性炎癥和嚴(yán)重?fù)p傷的重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，H2O2模型組IL-1β水平增加 51.34% (P<0.01)，TNFα 含量增加 37.49%(P<0.01)；而與H2O2模型組比較，RME預(yù)處理組的TNFα分別降低31.15%、25.52% 和20.52%(P<0.05,P<0.01)；IL-1β含量分別下降為37.01%、21.77%和20.56% (P<0.05,P<0.01)。見圖 2、圖3。

圖2 RME對(duì)培養(yǎng)液上清TNFα含量的影響

注：*P<0.01vs對(duì)照組，##P<0.05vs損傷組

A: 正常對(duì)照組; B: 損傷組; C: 10μg·L-1RME; D: 20 μg·L-1RME; E: 50 μg·L-1RME

圖3 RME對(duì)培養(yǎng)液上清IL-1β含量的影響

注：*P<0.01vs對(duì)照組，##P<0.05vs損傷組

A: 正常對(duì)照組; B: 損傷組; C: 10μg·L-1RME; D: 20μg·L-1RME; E: 50 μg·L-1RME

2.3RME預(yù)處理對(duì)PC12凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較，H2O2損傷12 h后，PC12細(xì)胞caspase-3的表達(dá)明顯增加，而RME三個(gè)劑量組均可明顯降低PC12細(xì)胞caspase-3的表達(dá)，且呈劑量依賴性效應(yīng)。見圖4。

圖4 RME干預(yù)對(duì)PC12細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

A: 正常對(duì)照組; B: 損傷組; C: 10μg·L-1RME; D: 20μg·L-1RME; E: 50μg·L-1RME

3 討 論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 發(fā)病原因十分復(fù)雜，現(xiàn)普遍認(rèn)為是一種以神經(jīng)纖維纏結(jié)、β-淀粉樣蛋白斑形成、神經(jīng)元丟失為主要病理特征的進(jìn)行性退化性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明了，但目前研究認(rèn)為腦內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)繼而誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可能是其重要發(fā)病機(jī)制之一，而氧化應(yīng)激誘發(fā)的自由基損傷是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的根本原因，因此抗氧化是保護(hù)神經(jīng)元的有效途徑[3-4]。H2O2是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的活性氧之一，其在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的OH-是氧化性最強(qiáng)的氧自由基，可自由進(jìn)入細(xì)胞，在許多神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型中可引起細(xì)胞損傷，因此本研究以H2O2作為損傷因素處理細(xì)胞,制備氧化應(yīng)激損傷模型，研究中藥照山白的抗氧化作用。

據(jù)《本草綱目》記載，照山白具有活血、通絡(luò)、祛風(fēng)、散寒等功效，改善全身的血液循環(huán)，固標(biāo)治本，扶正驅(qū)邪。已有研究顯示，服用20%照山白酊，經(jīng)臨床觀察200例，降壓總有效率為74%。有研究顯示，照山白酊劑中主要藥效成分金絲桃苷，具有抗炎、解痙、利尿、止咳、降壓、降低膽固醇、蛋白同化、局部和中樞鎮(zhèn)疼以及對(duì)心、腦血管的保護(hù)作用等多種生理活性，是一種重要的天然產(chǎn)物。能有效抑制缺氧缺糖-再灌注損傷后腦片甲躦(formazan)含量下降，增加缺血區(qū)腦片皮層和紋狀體的存活神經(jīng)元數(shù)目，使神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，分布良好。抑制SOD、LDH及谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性的下降。其作用機(jī)制可能與自由基清除，抑制Ca2+內(nèi)流及抗脂質(zhì)過氧化物形成等有關(guān)[5-6]。

本研究中經(jīng)H2O2損傷后PC12細(xì)胞的存活率下降；介導(dǎo)炎性損傷的重要的白介素家族成員TNFα、IL-1β的合成與表達(dá)增加；caspase-3的表達(dá)也明顯增高。提示TNFα、IL-1β在早期的氧化損傷刺激時(shí)釋放量增多，是參與氧化損傷、凋亡的重要細(xì)胞因子。 而照山白總黃酮預(yù)處理后，則顯示可明顯抑制炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-1β的合成與表達(dá)；抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)，且此效應(yīng)呈劑量依賴性。

本研究結(jié)果提示，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生、保護(hù)細(xì)胞免于炎性損傷以至于凋亡可能是照山白總黃酮發(fā)揮抗氧化和抑制神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12凋亡的作用機(jī)制。

[1] 宋立仁, 洪恂, 丁緒亮, 等. 現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001：40-80.

[2] Ducrey B, MarstonA, Gohring S, et al. Inhibition of 5 alphareductase and aromatase by the ellagitannins oenothein A and oenothein B from Epilobiumspecies[M]. Planta Med, 1997, 63(2): 111-114.

[3] Cagnin A. Positron emission tomography imaging of neuro inflammation[J]. Neurotherapeutics, 2007, 4: 443-452.

[4] Quinn J. Inflammation and cerebral amyloidosis are disconnected in an animal model of Alzheimer's disease[J]. J Neuroimmunol, 2003, 137: 32-41.

[5] 楊秀嶺, 袁志芳, 張?zhí)m桐, 等. 照山白總黃酮藥理作用研究[J]. 中草藥, 2006, 37(4): 583-585.

[6] 夏重道，杜安全，王紅萍，等照山白有效成分的化學(xué)研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，13(4)：99.