王曉嵐， 姚文杰， 苑 亮

（江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

白首烏中多糖等活性成分對(duì)酪氨酸酶活力的影響

王曉嵐， 姚文杰， 苑 亮

（江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

為了探討白首烏對(duì)黑素合成的影響，從白首烏中提取分離了多糖、C21甾苷及磷脂，用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法測(cè)定了白首烏含有的多糖、C21甾苷及磷脂對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力的影響。結(jié)果表明白首烏含有的多糖對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力有顯著的抑制作用，IC50為31.8μg/mL，多糖是酪氨酸酶的可逆性抑制劑，抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，磷脂對(duì)酪氨酸酶的抑制作用較弱，而C21甾苷對(duì)酪氨酸酶有激活作用。提示白首烏含有的多糖有可能被用作皮膚增白劑或作為色素沉著抑制劑，也有可能成為安全有效的食品褐變抑制劑。

白首烏；多糖；酪氨酸酶；黑素合成；抑制作用

酪氨酸酶是一種含銅的多酚氧化酶，它是生物體黑素合成過(guò)程中的限速酶，催化酪氨酸羥化為多巴、多巴氧化為多巴醌以及5，6-二羥基吲哚（DHI）氧化為5，6-吲哚醌3個(gè)步驟。其表達(dá)和活性決定著黑色素生成的量和速度[1]。反應(yīng)過(guò)強(qiáng)可引起黑素過(guò)多癥，如雀斑、黃褐斑等，黑色素生成過(guò)多是黃褐斑形成的根本原因[2]；反應(yīng)過(guò)弱或缺乏反應(yīng)，則可引發(fā)白發(fā)、白癜風(fēng)等。它的活性決定著黑色素的合成及合成量的多少，控制其活力即可控制黑色素的生成量。

濱海白首烏 （文中簡(jiǎn)稱(chēng)白首烏）是蘿摩科（Asclepiadaceae）馬利筋亞科（Asclepioideae）鵝絨藤屬 （Cynanchum linn）植物耳葉牛皮消（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight）的塊根，在江蘇省濱?？h廣泛種植和食用，是臨床常用的補(bǔ)益和抗衰老中藥，自古以來(lái)就被視為攝生防老、益精養(yǎng)顏的珍品[3]，至今種植地的人們用它外涂去除皮膚色斑?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白首烏中含有多種活性成分，如C21甾苷、多糖、磷脂等。作者將分別檢測(cè)這些成分對(duì)酪氨酸酶活力的影響，從而探討白首烏影響黑素合成的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白首烏藥材為江蘇省鹽城市首烏科技發(fā)展有限公司惠贈(zèng)，并經(jīng)該公司高級(jí)工程師孫春詩(shī)鑒定。藥材于通風(fēng)、干燥、避光處保存。蘑菇酪氨酸酶（EC.1.14.18.1，比活力為5 370 U/mg）及左旋多巴 （ldopa）均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備

R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；AL 104型電子分析天平，梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司制造；Muitiskan MK3多功能酶標(biāo)儀，上海雷勃分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 C21甾苷提取參照文獻(xiàn)[3]稱(chēng)取白首烏粉末500 g，加入1.5 L 95%乙醇加熱回流3 h，過(guò)濾得到醇提液。濾渣再經(jīng)乙醇提取兩次。提取液經(jīng)減壓濃縮，室溫?fù)]干溶劑后，得到醇提物。將此提取物溶于甲醇水溶液（v∶v=9∶1）中，用石油醚振搖脫脂 3 次，萃余液加適量的蒸餾水減壓濃縮回收甲醇，以氯仿進(jìn)行多次萃取。將氯仿萃取液合并，濃縮至小體積后滴加于5倍石油醚中，攪拌分散，析出沉淀物，經(jīng)過(guò)濾干燥得總甾苷10.67 g。

1.3.2 多糖提取參照文獻(xiàn)[4]白首烏粉20 g經(jīng)多次乙醇提取后，取殘?jiān)L(fēng)干，按照料液比1∶20進(jìn)行沸水浸提，提取液用α-淀粉酶、糖化酶去淀粉，用木瓜蛋白酶及Sevag試劑（氯仿∶正丁醇為5∶1）去除蛋白質(zhì)，上清液濃縮至一定體積，加入乙醇沉淀，經(jīng)離心分離沉淀后，依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得白首烏多糖1.39 g。

1.3.3 磷脂提取參考文獻(xiàn)[5-6]，白首烏粉200 g用 Folch 試劑（v（氯仿）∶v（甲醇）=2∶1）800 mL 經(jīng)回流4 h，過(guò)濾后濾渣重復(fù)提取兩次，提取液濃縮至干，并用適量氯仿溶解，經(jīng)5倍石油醚沉淀甾體類(lèi)化合物，離心分離得到的上清液通過(guò)減壓濃縮揮干溶劑后，得到總磷脂2.96mg。

1.3.4 3種提取物影響酪氨酸酶活力分析方法取適量總甾苷、多糖、總磷脂分別用溶劑（丙二醇∶乙酸乙酯∶磷酸鹽緩沖液體積比=9∶1∶18）溶解配制成濃度為1 mg/mL的溶液（多糖則用磷酸鹽緩沖液溶解配制，3種提取物在反應(yīng)體系的終濃度為0.2mg/mL），通過(guò)酶促反應(yīng)檢測(cè)其對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響。取待測(cè)物溶液50μL，并用pH 6.8磷酸鹽緩沖液適量稀釋至140μL與酪氨酸酶液 （25 U/mL）50 μL混合，于37℃孵育5 min，加入15 mmol/L的ldopa溶液60μL，繼續(xù)孵育2 min，立即于酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)光吸收值。酪氨酸酶抑制率按以下公式計(jì)算[7-8]：

酶抑制率（%）=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）*100

式中：A=A492-藥+酶；B=A492-藥-酶；C=A492+藥+酶；D=A492+藥-酶。

1.3.5 多糖對(duì)酪氨酸酶抑制作用及機(jī)理探討把多糖用磷酸鹽緩沖液稀釋為不同濃度（終濃度分別為 0.01、0.02、0.04、0.08、0.12 mg/mL），按上述方法測(cè)光吸收值，其光吸收值隨時(shí)間變化的曲線即多糖抑制酪氨酸酶催化氧化底物的反應(yīng)進(jìn)程曲線。酶的終濃度為 9.2μg/mL，l-dopa溶液的終濃度為 3.6 mmol/L。

在含上述濃度的多糖抑制酪氨酸酶測(cè)活體系中，確定底物為l-dopa溶液，其用量為60μL（終濃度為3.6 mmol/L），加入不同濃度的酪氨酸酶，測(cè)定酶活力與酶濃度的關(guān)系，通過(guò)作圖法判斷抑制劑的作用機(jī)理。

上述濃度的多糖抑制酪氨酸酶測(cè)活體系中，確定酪氨酸酶溶液的用量為50μL（終濃度為9.2μg/mL），加入不同體積的l－dopa溶液，多糖對(duì)酪氨酸酶抑制作用類(lèi)型的測(cè)定采用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法作圖判斷，抑制常數(shù)通過(guò)直線的斜率和縱軸截踞對(duì)效應(yīng)物含量二次作圖測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 白首烏不同提取物對(duì)酪氨酸酶活力的影響

由圖1可知，從白首烏中分離出的C21甾苷對(duì)酪氨酸酶有激活作用（抑制率為負(fù)），多糖對(duì)酪氨酸酶有顯著的抑制作用，而磷脂對(duì)酶的抑制作用較弱。

圖 1 白首烏 C21甾苷（1）、多糖（2）、磷脂（3）對(duì)酪氨酸酶活力的抑制率Fig.1 Inhibition of tyrosinase activity by C21 steroidal glycosides （1），soluble polysaccharides （2），and phosphatide（3） from Cynanchum auriculatum

2.2 多糖對(duì)酪氨酸酶抑制作用及機(jī)理

多糖影響酪氨酸酶催化l－dopa氧化不存在遲滯過(guò)程，酶作用的進(jìn)程曲線為直線，在反應(yīng)體系中加入多糖后，直線的斜率隨著加入的多糖濃度增大而下降（圖2），說(shuō)明多糖對(duì)酪氨酸酶活力有抑制作用。

多糖對(duì)酪氨酸酶活力的濃度效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著抑制劑濃度的增大，相對(duì)酶活力下降，導(dǎo)致酶活力下降一半所需的抑制劑濃度（IC50）為31.8 μg/mL。

圖4表示酪氨酸酶經(jīng)多糖作用后的剩余酶活力與加入酶量間的關(guān)系，得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線，隨著加入的多糖濃度增大，直線的斜率降低，說(shuō)明多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過(guò)程，多糖是酪氨酸酶的可逆抑制劑，增加效應(yīng)物含量導(dǎo)致酶活力的下降是通過(guò)抑制酶活力降低其催化速率，而不是通過(guò)降低其有效的酶量而使其活力下降。

圖2 白首烏多糖對(duì)酪氨酸酶抑制作用的進(jìn)程曲線Fig.2 Progress curves for inhibition of tyrosinase by polysaccharides from Cynanchum auriculatum

圖3 白首烏多糖對(duì)酪氨酸酶活力的影響Fig.3 Effect of polysaccharides from Cynanchum auriculatum on tyrosinase activity

圖4 白首烏多糖對(duì)酪氨酸酶抑制機(jī)理Fig.4 Inhibitory mechanism of polysaccharides from Cynanchum auriculatum on tyrosinase activity

圖5為多糖對(duì)酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖，得到1組縱軸截距不變的直線，說(shuō)明多糖作為酪氨酸酶抑制劑，它不改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度（Vmax），只影響米氏常數(shù)（Km），且Km值隨著抑制劑濃度的增大而增大，表現(xiàn)酶對(duì)底物的親和力下降，底物與抑制劑同酶分子的結(jié)合是相互競(jìng)爭(zhēng)的，其抑制劑類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性類(lèi)型。圖中表現(xiàn)出酶反應(yīng)的Vmax不隨抑制劑濃度增大而變化，說(shuō)明多糖只能與游離酶（E）結(jié)合，而不能與酶-底物絡(luò)合物（ES）結(jié)合。

圖5 多糖對(duì)酪氨酸酶抑制類(lèi)型的測(cè)定Fig. 5 Determination of the inhibitory type of polysaccharides from Cynanchum auriculatum on tyrosinase activity

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)白首烏含有的不同活性成分影響酪氨酸酶活性的考察表明：白首烏的C21甾苷對(duì)酪氨酸酶有激活作用，進(jìn)一步的研究結(jié)果將在另文發(fā)表。白首烏多糖對(duì)酪氨酸酶有顯著的抑制作用，IC50為31.8μg/mL，多糖是酪氨酸酶的可逆性抑制劑，抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。該研究結(jié)果不僅為白首烏治療色素障礙性皮膚病提供了理論依據(jù)，并且白首烏多糖由于其可食性，對(duì)改善食品褐變現(xiàn)象也有實(shí)用前景，因?yàn)槭称芳庸づc儲(chǔ)藏過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生酶促褐變等變色現(xiàn)象，引起褐變的酶主要就是酪氨酸酶[9]。絕大多數(shù)褐變影響食品加工與儲(chǔ)藏的效果和質(zhì)量的穩(wěn)定，盡可能降低酪氨酸酶的活性有助于改善食品褐變。

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Effect of the Polysaccharides and Other Active Extracts from Cynanchum auriculatum on the Activity of Tyrosinase

WANG Xiao-lan， YAO Wen-jie， YUAN Liang
（Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

To explore the effect of Cynanchum auriculatum on melanin synthesis.The polysaccharides，C21steroidal glycosides，and phosphatide were extracted and separated from Cynanchum auriculatum.The effects of polysaccharides，C21steroidal glycosides，and phosphatide extracted from Cynanchum auriculatum on mushroom tyrosinase activity were detected respectively by measuring the oxidation rate of l-dopa.The results indicated that the soluble polysaccharides of Cynanchum auriculatum could inhibit the activity of mushroom tyrosinase obviously and concentration that resulted in 50%activity lost for diphenol oxidase activity was 31.8μg/mL.The polysaccharides from Cynanchum auriculatum was a reversible competitive inhibitor for the oxidation of l-dopa.The phosphatide extracted from Cynanchum auriculatum had weak inhibitory effect on activity ofmushroom tyrosinase while the C21steroidal glycosides had activation effect on the tyrosinase.The results suggest that polysaccharides of Cynanchum auriculatum might be used as a skin whitening agent or as a hyperpigmentation inhibitor.It also have the potential to be further developed into a safe and effective food browning inhibition agent.

Cynanchum auriculatum，polysaccharides，tyrosinase，melanin synthesis，inhibition

王曉嵐（1962—），女，江蘇無(wú)錫人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)及功能性食品研究。E-mail：wangxl@jiangnan.edu.cn

R 282.6

A

1673—1689（2013）10—1097—04

2013-07-15

江南大學(xué)科研項(xiàng)目（210000-01205028）。