晁宏圖 鄧君麗 馬一鳴 王 莉

上皮性卵巢癌是婦科惡性程度最高的腫瘤，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，多烯紫杉醇與鉑類聯(lián)合是治療卵巢癌的金標準，但容易產(chǎn)生耐藥。5年生存率并無明顯提高，為30%左右。LBH589是一種新型的HDAC（組蛋白去乙?；福┮种苿?，本研究探討LBH589對上皮性卵巢癌OVCAR-3細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

LBH589購自美國Selleck公司，用DMSO配成10 mmol/L備用。RPMI 1640、新生小牛血清為Gibco公司產(chǎn)品，MTT為Sigma產(chǎn)品。β-tubulin購自美國Abcam公司，Caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2購自美國Epitomics Irc公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) OVCAR-3購自美國菌種保藏中心（ATCC）（Rockville，MD，USA）。用含10%新生小牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3天換液傳代1次。

1.2.2 細胞抑制率的測定 用MTT法檢測細胞增殖抑制率，取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，將2×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板，試驗分為陰性對照組和藥物試驗組，并設未加細胞、只加培養(yǎng)液的空白對照組，每個組設3個復孔，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的LBH589繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL/孔 MTT（5 mg/mL），37°C孵育4 h后，離心1 000 r/min，10 min，棄上清加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，至紫色結(jié)晶完全溶解，選擇560 nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度OD值（A值），以空白對照OD值調(diào)零，試驗重復3次，計算抑制率（%）=1-（試驗組A值-空白對照組A值）/（陰性對照組A值-空白對照組A值）×100%。

1.2.3 AO/EB熒光染色 取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，用5×104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，試驗分為陰性對照組和藥物試驗組，培養(yǎng)24h后加入0.01×nM LBH589繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用2.5 g/L胰酶消化后離心，用PBS洗后離心棄上清，加入100 μL吖啶橙（AO 100 μg/mL）、溴化乙啶（EB 100 μg/mL）混合后滴片，立即用熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot檢測 細胞接種和藥物濃度與上述相同。處理細胞48 h后提取蛋白質(zhì)，BCA方法進行蛋白定量，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶于37℃溫箱內(nèi)封閉纖維素膜30 min，加入一抗處理4℃過夜，第二天與二抗雜交1 h后TBST洗滌3次，用WB成像系統(tǒng)及分析圖像軟件（ImageQuant LAS4000）發(fā)光顯像。檢測蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 4.00軟件進行one-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 LBH589對OVCAR-3細胞增殖的影響

不同濃度（0～10 μM）LBH589處理OVCAR-3細胞24、48、72 h可明顯抑制OVCAR-3細胞增殖，并呈劑量及時間依賴性（圖1）。LBH589作用于OVCAR-3細胞48 h半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.12 μM。同時，倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)發(fā)生改變，發(fā)生固縮、碎裂，失去貼壁能力，呈現(xiàn)明顯的凋亡特征。

圖1 LBH589對OVCAR-3細胞的增殖抑制作用Figure1 Inhibitory effect of LBH589 on the proliferation of the human ovarian cancer cell line OVCAR-3

2.2 AO/EB染色

正常對照細胞主要呈細胞核綠色淡染，胞漿桔黃或桔紅色，早期凋亡細胞的細胞膜尚完整，胞漿發(fā)生固縮，細胞核固縮或碎裂，呈致密濃染的黃綠色，有的還可見碎塊狀。晚期凋亡細胞的胞膜通透性增加，EB能夠通過，呈鮮紅色固縮體或碎塊，壞死細胞為鮮紅色的膨大細胞（圖2）。

圖2 AO/EB染色法觀察OVCAR-3細胞凋亡的形態(tài)學變化Figure2 Morphological changes in apoptotic OVCARr-3 cell observed via AO/EB assay

2.3 LBH589對OVCAR-3細胞相關凋亡蛋白的影響

LBH589作用OVCAR-3細胞48 h后，Caspase-3、PARP-85kD蛋白表達增加，pro-Caspase-3、PARP-115kD蛋白無明顯變化，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡指標Bax蛋白表達增多。

圖3 LBH589處理OVCAR-3細胞對凋亡蛋白的影響Figure3 Effect of LBH589 treatments on apoptosis-related proteins of the human ovarian cancer cell line OVCAR-3

3 討論

LBH589是新一代廣譜的組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，在多項體外研究證明LBH589能誘導多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、乳腺癌細胞的凋亡［1-3］。有的已經(jīng)進入臨床試驗［4-5］，為了明確LBH589對卵巢癌細胞的抗腫瘤作用，本研究從抑制細胞增殖和促進細胞凋亡兩方面觀察其對卵巢癌細胞OVCAR-3細胞株的影響。

細胞增殖與細胞周期的運轉(zhuǎn)有密切的關系，調(diào)控細胞周期可以影響細胞增殖。細胞周期的調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生的重要機制。本研究用MTT法檢測細胞增殖抑制率，發(fā)現(xiàn)LBH589抑制了OVCAR-3細胞的增殖，并隨著劑量和時間的增加，抑制率增加。LBH589可使細胞周期阻滯于G2/M期［6-7］，LBH589影響細胞周期進程可能涉及多個細胞周期調(diào)控相關蛋白，說明LBH589有較廣的抗癌靶點。

AO/EB染色法從形態(tài)上觀察LBH589作用OVCAR-3細胞后凋亡的變化。AO可以透過細胞膜，將細胞核內(nèi)的DNA染成綠色，胞漿內(nèi)的RNA呈桔紅色。壞死細胞不僅細胞膜不完整，而且線粒體腫脹，為鮮紅色的膨大細胞［8］。LBH589處理OVCAR-3細胞后可以觀察到此變化，說明LBH589作用OVCAR-3細胞后可以誘導細胞凋亡，且和藥物濃度及作用時間呈正相關。

凋亡信號通路缺陷是許多腫瘤組織的特性，并和腫瘤抗藥性相關。促進腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的有效手段。Bcl-2家族是一類調(diào)控細胞凋亡的關鍵蛋白，研究表明，HDAC抑制劑可以通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達，活化凋亡信號轉(zhuǎn)導通路，進而誘導細胞凋亡［9］。PARP的剪切通常認為是Caspase-3途徑激活的標志［10］。通過Western blot檢測凋亡通路的關鍵分子發(fā)現(xiàn)，LBH589作用OVCAR-3細胞48 h后底物PARP-85 kD增加，抗凋亡指標Bcl-2蛋白表達減少，促凋亡指標Bax蛋白表達增加。因此，LBH589誘導卵巢癌細胞OVCAR-3發(fā)生凋亡的機制主要是通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2的表達，激活Caspase-3凋亡通路，進而誘導腫瘤細胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，LBH589可以明顯抑制卵巢癌細胞OVCAR-3的增殖，與劑量及作用時間呈正相關，通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，誘導細胞凋亡，具有抗腫瘤作用，為將來的臨床試驗和應用提供了實驗依據(jù)。

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