第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院（西安710038） 李三陽(yáng) 李 怡 苗 卓 張 哲 尹國(guó)武

胚胎停育是指妊娠早期胚胎發(fā)育自然終止、胚胎丟失的病理過(guò)程，其妊娠結(jié)局常常為稽留流產(chǎn)和不全流產(chǎn)［1］。近年來(lái)胚胎停育患者有增加趨勢(shì)，有研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞增殖不良、浸潤(rùn)異常可能是導(dǎo)致早期胚胎停育的原因之一［2］。E－鈣粘連蛋白（E－Cadherin，ECad）是一種鈣依賴粘附分子，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞表面，其主要功能是介導(dǎo)特定組織或器官的同型細(xì)胞間粘附作用，維持上皮細(xì)胞層的完整性和極性，參與胚胎的發(fā)育及組織形成及細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵蝕等活動(dòng)，其表達(dá)水平的升高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn)能力下降，表達(dá)降低則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力增強(qiáng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)E－Cad在滋養(yǎng)細(xì)胞中也有表達(dá)，可以影響滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。我們應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT－PCR）技術(shù)檢測(cè)胚胎停育患者絨毛和蛻膜中E－Cad mRNA水平的表達(dá)量，進(jìn)一步研究E－Cad mRNA的表達(dá)水平和胚胎停育的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選自2010年4～12月間來(lái)我院婦產(chǎn)科門診就診的胚胎停育患者50例，臨床確診為胚胎停育（B超檢查宮腔內(nèi)可見(jiàn)孕囊，未見(jiàn)胚芽或原始心管搏動(dòng)）。所有對(duì)象均月經(jīng)規(guī)律（月經(jīng)周期28～32d），既往均無(wú)自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，無(wú)染色體、解剖、內(nèi)分泌方面的異常以及感染、自身免疫性疾病史，且未采取任何藥物干預(yù)。選擇與胚胎停育組相同時(shí)期內(nèi)到我院就診的孕期10周以內(nèi)此次妊娠期間無(wú)先兆流產(chǎn)癥狀，B超證實(shí)胚胎發(fā)育一切正常，要求停止妊娠的正常婦女50例為正常對(duì)照組。兩組間年齡和孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表1。

表1 絨毛和蛻膜標(biāo)本詳細(xì)資料（n＝50）

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①器械的準(zhǔn)備：彎盤、鑷子等耐高溫物品180℃6h，消除RNA酶，凍存管，槍頭用0．1%DEPC水浸泡過(guò)夜，高壓蒸汽滅菌，烤干備用。②絨毛和蛻膜標(biāo)本的采集：兩組患者于人流術(shù)后將吸出的組織倒入已消毒的彎盤中，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)漂洗絨毛和蛻膜組織，用無(wú)菌紗布吸干表面的水分放入事先準(zhǔn)備好的凍存管中，標(biāo)記好放入液氮，－80℃保存?zhèn)溆谩＂劢M織RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄：組織RNA的提取按照RNA Plus（大連寶生）逆轉(zhuǎn)錄TAKARA（大連寶生）的試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。④熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT－PCR）：qRT－PCR 以 GAPDH 為內(nèi)參照基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每例樣品均設(shè)4個(gè)平行重復(fù)孔。引物序列見(jiàn)表2（引物有北京奧科合成）。

表2 qRT－PCR引物序列表

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值均以±s表示，兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 qRT－PCR結(jié)果 應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260nm及280nm的吸光值。OD值均在1．8～2．0之間，表明RNA的質(zhì)量良好。在絨毛標(biāo)本中，E－Cad mRNA在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于對(duì)照組（t＝29．24，P＜0．05）。（見(jiàn)表3）。在蛻膜標(biāo)本中，E－Cad mRNA在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于對(duì)照組（t＝19．76，P＜0．05）。（見(jiàn)表4）。

2 qRT－PCR結(jié)果的驗(yàn)證 qRT－PCR結(jié)果可能存在假陽(yáng)性，我們對(duì)qRT－PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示E－cad在120bp，GAPDH在196bp處，目的條帶在預(yù)期條帶處。（胚胎停育患者與正常人流者絨毛和蛻膜qRT－PCR結(jié)果的驗(yàn)證分別見(jiàn)附圖）。

表3 E－Cad在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組絨毛中的表達(dá)（±s）

表3 E－Cad在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組絨毛中的表達(dá)（±s）

注：與對(duì)照組相比＊P＜0．05

組 別 n E－Cad／GAPDH實(shí)驗(yàn)組 50 0．875±0．07＊對(duì)照組 50 0．337±0．11

表4 E－Cad在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛻膜中的表達(dá)（±s）

表4 E－Cad在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛻膜中的表達(dá)（±s）

注：與對(duì)照組相比＊P＜0．05

組 別 n E－Cad／GAPDH實(shí)驗(yàn)組 50 0．927±0．12＊對(duì)照組 50 0．512±0．08

附圖 絨毛及蛻膜中qRT－RCP結(jié)果后驗(yàn)證

討 論

人類的成功妊娠，需要來(lái)自胚胎的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)揮類似腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的特性。正常妊娠胎盤的發(fā)育過(guò)程中一部分早期滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)子宮蛻膜，分化成為具有侵蝕力的細(xì)胞表型，其深度可達(dá)子宮肌層內(nèi)的1／3。妊娠早期，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（CTB）在胚泡植入子宮壁后即分化為絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（EVT）。其中EVT是具有浸潤(rùn)能力的滋養(yǎng)細(xì)胞，其浸潤(rùn)能力在滋養(yǎng)細(xì)胞正常侵入子宮肌層的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。因此，早期妊娠過(guò)程中滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮肌層的適度浸潤(rùn)是妊娠成功的關(guān)鍵。

絨毛主要由滋養(yǎng)細(xì)胞分化而來(lái)，其主要成分為絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，具有浸潤(rùn)功能。滋養(yǎng)細(xì)胞分化與浸潤(rùn)能力決定胎盤能否正常發(fā)育。E－Cad是鈣依賴型細(xì)胞粘連糖蛋白，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞表面，介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附作用，并連接細(xì)胞內(nèi)骨架，影響細(xì)胞的分化與浸潤(rùn)能力。E－Cad介導(dǎo)的粘附系統(tǒng)是已被公認(rèn)的“浸潤(rùn)抑制系統(tǒng)”，有研究表明E－Cad的表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞的分化浸潤(rùn)有一定的關(guān)系［5］，妊娠早期任何部位的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（CTB）表面均有E－Cad的粘附與表達(dá)，有利于胚泡的粘附和植入［6］。近來(lái)研究表明，E－Cad等粘附分子參與母胎界面微環(huán)境的構(gòu)成，在胚胎著床和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用［4］。隨著妊娠的進(jìn)展，E－Cad在絨毛各部位的表達(dá)逐漸下降，這有利于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入，保證母胎之間正常生理功能的運(yùn)行，封閉E－Cad可顯著提高滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)行為［7］。本研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育絨毛中E－Cad在mRNA水平的表達(dá)低于正常人流者，研究結(jié)果與黃敬明相符。黃敬華等［8］用免疫組化的方法研究表明E－Cad在胚胎停育絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞表面表達(dá)增加。Shih等［9］研究發(fā)現(xiàn)升高E－Cad的表達(dá)水平后，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵蝕能力下降。E－Cad的表達(dá)水平可以有效的反應(yīng)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，表達(dá)水平過(guò)高則引起滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕能力不足，導(dǎo)致自然流產(chǎn)［10］。因此我們推測(cè)E－Cad在胚胎停育患者絨毛中的高表達(dá)引起滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降，無(wú)法有效完成血管重鑄，造成胎盤淺著床，從而導(dǎo)致自然流產(chǎn)等妊娠結(jié)局。

蛻膜組織是子宮內(nèi)膜間質(zhì)受蛻膜化誘導(dǎo)因子刺激而增殖和再分化形成的一種特殊組織，子宮內(nèi)膜的蛻膜和蛻膜功能的正常表達(dá)，對(duì)胚胎著床、妊娠建立與維持，以及分娩發(fā)動(dòng)均起著極為重要的作用。E－Cad即為子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)的一種粘附分子，在鈣離子存在的條件下，通過(guò)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的粘附。本研究用qRT－PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在胚胎停育蛻膜中E－Cad在mRNA水平的表達(dá)高于正常人流組。劉蕓等［11］證明在增殖期到分泌期，子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞表達(dá)E－Cad逐漸增加，分泌晚期及蛻膜期表達(dá)降低，揭示E－Cad與胚泡的植入有密切關(guān)系。當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞需要進(jìn)一步與子宮內(nèi)膜相容時(shí)，如在分泌晚期和早孕期，上皮細(xì)胞表達(dá)E－Cad降低，使得細(xì)胞相互粘附力降低，有利于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入。結(jié)合本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)E－Cad在組織蛻膜組織中的表達(dá)增高可能影響胚胎的著床、妊娠建立與維持，導(dǎo)致胚胎停育等妊娠結(jié)局。

胚胎的成功著床取決于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入性和子宮內(nèi)膜的容受性［12］。E－Cad在胚胎停育患者絨毛中的高表達(dá)引起滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降，無(wú)法有效完成血管重鑄，造成胎盤淺著床，可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)等妊娠結(jié)局。E－cad在蛻膜組織中的高表達(dá)可能影響滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜的容受性，進(jìn)而影響胚胎的著床、妊娠建立與維持，導(dǎo)致自然流產(chǎn)等妊娠結(jié)局。因此，E－Cad在絨毛和蛻膜中的高表達(dá)可能通過(guò)上述機(jī)制影響胚胎發(fā)育導(dǎo)致自然流產(chǎn)，本研究可能為胚胎停育的機(jī)制提供新的診斷思路。

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