高 翔 宋錦璘* 鄧 鋒 趙純亮 王智彪

1（重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學研究中心，重慶 401147）2（超聲醫(yī)學工程重慶市市級重點實驗室，重慶 400016）

引言

先天畸形、外傷或牙周病等因素，常導致牙槽骨發(fā)生不同程度缺損，造成牙齒支持組織破壞，牙周附著喪失，最終導致牙喪失［1］。目前，治療牙槽骨缺損的主要方法有植骨術、引導組織再生術（guided tissue regeneration，GTR）以及引導骨組織再生術（guided bone regeneration，GBR）等［2］。其中GBR作為一種基于GTR理論發(fā)展而來的再生性手術，將GTR術與骨移植治療聯合應用，可以獲得牙槽骨再生［3］。GBR術后，牙槽骨完全修復上頜區(qū)約需6個月，下頜區(qū)約需3個月［4］。術后由于口腔衛(wèi)生差、吸煙、牙齦厚度不足等原因，常導致屏障膜早期暴露而影響療效［5－6］，亟待促進牙槽骨修復、縮短修復時間的輔助療法。

低強度脈沖超聲波（lowintensitypulsed ultrasound，LIPUS）為強度低于100 mW/cm2的脈沖式超聲波，具有產熱相對較弱，無侵入性，具有促進牙周組織修復的潛力［7－13］。以往研究側重LIPUS單獨處理對牙周組織的影響［8－10］，尚未見 GBR與LIPUS聯合應用對牙周骨開窗缺損生物學改建效應的相關報道。

本研究應用GBR輔以LIPUS處理Beagle犬尖牙牙周骨開窗缺損模型，通過Micro-CT檢測及組織學分析，探討LIPUS對GBR修復牙周骨缺損的影響，以期為LIPUS輔助治療提高臨床GBR療效提供前期實驗參考。

1 材料和方法

1.1 實驗對象和材料

1.1.1 實驗對象

12～18個月齡健康雄性beagle犬5只（重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供），體重7～11 kg。尖牙無齲壞，牙周情況良好，牙齦無紅腫出血，牙槽骨無缺損。選擇尖牙為實驗牙，每只Beagle犬4顆尖牙按簡單隨機法分配到4個治療組：LIPUS（90 mW/cm2，20 min/d）組、LIPUS（90 mW/cm2，20 min/d）+GBR組、GBR組、空白對照組。每組5顆實驗牙。

1.1.2 實驗藥品

速眠新Ⅱ注射液（批號：005013，規(guī)格：1.5 mL/支，軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所）、地西泮注射液（批號：H50021483，規(guī)格：2mL：10 mg/支，西南藥業(yè)股份有限公司）、康派特醫(yī)用膠（北京瞬康醫(yī)用膠有限公司）、醫(yī)用超聲耦合劑、2％鹽酸利多卡因、鹽酸腎上腺素注射液等。

1.1.3 實驗材料和儀器

聚四氟乙烯（polyetrafluoroethylene，PTFE）膜（FP301100，厚度：0.01 mm，Goodfellow Cambridge Ltd，英國）、低強度脈沖超聲實驗儀（國家超聲醫(yī)療工程中心提供）、切片機（Leica RM2135型轉輪，德國Leica公司）、Nikon DXM1200和NIS-Elements F3.0計算機圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon公司）、Micro-CT（μCT80瑞士）、HPIntegrity工作站（Itanium?2處理器，64位OpenVMS操作系統(tǒng)）等。

1.2 方法

1.2.1 構建Beagle犬尖牙牙周骨缺損模型

速眠新Ⅱ注射液復合地西泮注射液對Beagle犬實施全身麻醉。麻醉后將Beagle犬固定，消毒鋪巾，口內2％碘酊消毒，75％酒精脫碘，嚴格無菌操作。含腎上腺素2％利多卡因注射液浸潤麻醉。實驗區(qū)頰側牙齦做三角形切口，翻開全厚粘骨膜瓣，高速裂鉆配合骨鑿制備大小5 mm×5 mm矩形牙槽骨缺損，完全暴露尖牙根面，刮除殘留牙周膜組織，平整根面，SSW HP-700裂鉆沿缺損邊緣在根面上做連續(xù)切跡以便組織學觀測，同時在尖牙牙冠做“L”形標記，指示缺損位置，冠部“—”形切跡距離矩形缺損冠向邊緣約15 mm（見圖1中（a）～（c））。

1.2.2 GBR手術

選擇下頜第一磨牙根分叉區(qū)牙槽骨作為供骨區(qū)，取適量牙槽骨，剪碎后放入生理鹽水中備用。將備用骨質植入GBR和LIPUS+GBR治療組缺損區(qū)，用量大致平齊缺損周圍骨緣。高溫消毒后的PTFE膜修整后（面積比缺損周緣大2～3 mm）用康派特醫(yī)用膠粘結固定于牙槽骨面，覆蓋植骨區(qū)［13］。生理鹽水沖洗后，齦瓣復位，4-0絲線縫合關閉創(chuàng)面（圖1中（d）～（f））。LIPUS組和空白對照組省略此步驟。術后連續(xù)4 d給予肌肉注射青霉素（80萬單位/d）預防感染，術后 1周內進軟食，每日用1.5％洗必泰局部沖洗，1周后拆線。

圖1 牙周手術過程。（a）～（c）骨開窗建模；（d）～（f）GBR手術Fig.1 The process of periodontal surgery.（a）～（c）Fenestration wounds modeling；（d）～（f）GBR operation

1.2.3 LIPUS參數設定及處理方法

基于安全無創(chuàng)性原則，LIPUS治療參數為ISATA 90 mW/cm2，頻率1.5 MHz，調制信號波寬200 μs，重復率1 kHz，處理時間20 min/d［12，14］。連續(xù)4周（28 d）每天輻照1次。參考標記線位置放置超聲治療儀探頭（見圖2）。

圖2 LIPUS處理Fig.2 LIPUS treatment

1.2.4 Micro-CT圖像三維重建

4周后，過量麻藥處死Beagle犬，用金屬片切片將上下頜尖牙完整取出，4％多聚甲醛液（pH=7）固定1周。Micro-CT運行參數為電壓55 kV，電流145 μA，圖像矩陣2 048像素×2 048像素，層距0.037 0 mm。將標本固定放置于掃描容器中，保證掃描平面與牙長軸垂直，掃描方向從尖牙冠部至根尖部。獲取Micro-CT掃描圖像（見圖3）后，在HP Integrity 64位工作站中對圖像進行重建分析。對實驗區(qū)進行三維重建，對不同組織通過不同顯色和透明度區(qū)別觀察缺損區(qū)牙槽骨再生情況。1.2.5 制備組織切片

圖3 尖牙掃描后重建圖像Fig.3 The reconstruction image of canine after scanning

Micro-CT檢測后，在生理鹽水沖洗下用金屬片切片將實驗區(qū)牙根及牙周組織（不包括牙齦）完整取下（邊界大小10 mm×10 mm）并修整。10％EDTA 37℃恒溫水浴脫鈣2個月后，常規(guī)梯度脫水，浸蠟，石蠟包埋，沿牙根長軸做頰舌向連續(xù)切片，切片厚度5 μm。每個組織塊選取中間段5張切片用于HE染色和Masson染色（4張HE染色，1張Masson染色）。計算機圖像分析系統(tǒng)顯微鏡下采集組織切片圖像。

1.2.6 組織學定量分析

用計算機圖像分析系統(tǒng)（Nikon DXM1200和NIS-Elements F3.0）采集40倍下切片圖像，并用IPP-6.0圖像分析軟件進行測量分析［7］，骨“開窗”缺損新生牙周組織生長模式如圖4所示，測量切片缺損總面積、新生骨組織面積。

圖4 骨“開窗”模型新生牙周組織生長模式圖（N：根面切跡；NC：新生牙骨質；NP：新生牙周膜；NB：新生牙槽骨；BM：聚四氟乙烯膜；ST：軟組織）Fig.4 The growth diagram of new periodontal tissue in fenestration defect（N：notch；NC：new cementum；NP：new periodontal ligament；NB：new bone；BM：PTFE membrane；ST：soft tissue）

（1）缺損初始面積（total defect area，TDA）：根面缺損的總面積。

（2）新生骨組織面積（new bone area，NBA）：缺損區(qū)新生骨組織的面積總和。

1.2.7 統(tǒng)計學處理

用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，數據用均數±標準差（ˉx±s）表示，對相關資料進行隨機區(qū)組設計的方差分析，組間比較進行LSD檢驗，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床愈合情況

骨開窗模型臨床愈合情況有以下3種：（1）失?。糊l瓣缺損，PTFE膜移位或脫落；（2）暴露：齦瓣缺損，PTFE膜暴露但沒有脫落；（3）完全愈合：牙齦愈合良好，PTFE膜未暴露。失敗和暴露牙位不納入測量分析。各實驗組臨床愈合情況見表1。

表1 各實驗組臨床愈合情況Tab.1 The clinical healing between groups

2.2 實驗區(qū)大體觀察

各組牙槽骨缺損面積均不同程度縮小，新生組織從缺損周圍標記處向中心生長，缺損處無明顯炎癥反應。LIPUS+GBR和GBR組PTFE膜被結締組織包裹，固定于原處，未發(fā)生明顯移位（見圖 5和圖6）。

圖5 術中缺損大小Fig.5 The size of defect in operation

2.3 Micro-CT三維重建圖像分析

從重建的三維圖像中觀察發(fā)現，各治療組牙槽骨均有一定程度的修復。未進行GBR術治療組，實驗牙內新生牙槽骨面積較進行GBR術治療組小，且牙槽骨表面空隙較多，提示新生牙槽骨的密度較低；進行GBR術的治療組，實驗牙新生牙槽骨密度較高，提示牙槽骨再生量較高；空白對照組新生牙槽骨表面空隙較多，提示新生牙槽骨密度較低，新生牙槽骨面積在各治療組中最小；LIPUS+GBR組新生牙槽骨表面空隙較少，新生牙槽骨面積最大，提示新生牙槽骨密度較高，牙槽骨再生量較高。

圖6 治療后缺損大小Fig.6 The size of defect after treatment

2.4 組織學觀察

2.4.1 LIPUS組：光鏡下可見豐富的成纖維細胞，

膠原纖維束及新生毛細血管；成牙骨質細胞、成骨細胞功能活躍（見圖7和圖8），Masson染色新生組織中成熟骨組織膠原分布較廣。

圖7 成牙骨質細胞及新生牙骨質（HE染色，200×）Fig.7 Cementoblast cells and new cementum（HE Staining，200×）

圖8 成骨細胞及新生牙槽骨（HE染色，400×）Fig.8 Osteoblasts and new alveolar bone（HE staining，200×）（HE staining，400×）

2.4.2 LIPUS+GBR組：PTFE膜與牙周組織接觸良好，未見膠原纖維束穿過，膜下膠原纖維束及新生毛細血管豐富；成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞功能活躍；少量尚未吸收改建，大小不等移植骨顆粒分布缺損區(qū)，大量功能活躍的成骨細胞以植骨顆粒為支架編織合成新骨（見圖9和圖10）；陳舊骨與新生骨之間有明顯交界線，Masson染色與LIPUS組類似。

圖9 PTFE膜與周圍組織（HE染色，40×）Fig 9 PTFE membrane in vivo（HE staining，40×）

圖10 超聲處理+GBR組織學表現（HE染色，40×）Fig.10 Histological performance in LIPUS+GBR group（HE staining，40×）

2.4.3 GBR組：缺損處以成纖維細胞及新生毛細血管為主，膠原纖維束較少，成牙骨質細胞靠近根面形成牙骨質，少量植骨顆粒散在分布，Masson染色新生組織中成熟骨組織膠原分布相對較少。

2.4.4 空白對照組：缺損處可見少量新生骨組織，新生骨組織以軟骨膠原纖維為主，Masson染色顯示主要為非成熟的骨組織膠原成分（見圖11）。

2.5 組織學定量檢測

各治療組TDA無顯著性差異（P＞0.05）；各治療組新生骨組織面積及新生骨占初始缺損面積百分比（NBA％），組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

圖11 空白對照組組織學表現。（a）HE染色，100×；（b）HE染色，200×；（c）染色Masson，100×Fig.11 Histological performance in control group.（a）HE staining，100×；（b）HE staining，200×；（c）Masson staining，100×

表2TDA，NBA及NBA％測量結果Tab.2 The measurements of TDA，NBA and NBA％

牙槽骨缺損修復的動物模型需滿足兩個要求：一是能夠真實反應牙周組織修復的過程；二是利于準確評估處理因素對牙周組織的生物學效應［15］。本研究選擇牙槽骨“開窗”模型為矩形“封閉”缺損，可有效排除外界感染因素的影響，有利于準確評估LIPUS在GBR治療中的生物學效應。

由于具有與人類相似的牙周組織結構，犬常被用于牙周動物實驗［16］。研究發(fā)現，犬下頜頰側5 mm直徑的環(huán)形牙槽骨開窗模型術后16周，通過自愈可獲得完全牙槽骨再生［17］。急性牙周損傷建模后，動物組織的自愈性常導致對治療方法效果的過高評介［18］。LIPUS處理時間過長，Beagle犬牙周組織的自愈性的影響可能會更大。Ikai等發(fā)現Beagle犬牙周翻瓣術后，連續(xù)4周LIPUS輻照后可以活化成骨細胞、牙周膜細胞，對牙周病組織愈合及牙槽骨修復有促進作用［11］。因此，本研究選擇4周LIPUS處理時間，不僅可減少Beagle犬牙周自愈性對實驗結果的干擾，而且有利于LIPUS與GBR聯合應用對牙槽骨缺損早期修復效應的研究。

Micro-CT是一種高分辨率的三維重建影像技術，具有對組織無創(chuàng)、精確度高、直觀性好等特點，主要應用于骨組織或口腔內牙體組織、牙槽骨組織的重建分析［19］。本實驗利用HP Integrity工作站對Micro-CT掃描圖像進行三維重建后，形態(tài)學觀察顯示，掃描后重建圖像，牙體組織和牙槽骨組織圖像清晰、真實、直觀，牙根面的骨缺損標記線明顯，為定量分析新生牙槽骨提供有力保證。但由于重建實驗區(qū)域圖像的密度值主要通過灰度值表達，在牙槽骨修復初期，骨纖維密度灰度值較低，在掃描圖像上可能無法顯示或者顯示灰度值偏低，檢測過程中可能造成部分樣本丟失，使檢測結果較實際組織成骨能力低［20］。此外，在圖像重建過程中，牙周膜和牙齦等低密度組織不能顯影，故Micro-CT無法對牙周膜和牙齦等組織的修復狀況進行分析。因此，Micro-CT對牙周組織修復的檢測具有一定的局限性，在實驗中應結合組織學分析，以提高牙周組織修復分析的準備度和精確度。

LIPUS作為一種非侵入性機械能，不僅可以誘導成骨細胞分化，刺激細胞、細胞外基質增殖，加快鈣鹽沉積［21］，而且能增強人牙骨質細胞堿性磷酸酶活性，促進膠原合成［22］。本研究中LIPUS組與LIPUS+GBR治療組HE染色切片可見大量成骨細胞與成牙骨質細胞，細胞形態(tài)成立方狀，核大，細胞功能活躍，說明LIPUS處理具有促進成骨細胞與成牙骨質細胞功能活性的作用。此外，通過Masson染色對骨組織膠原的染色反應，可以評價骨質的成熟度［23］，LIPUS組與LIPUS+GBR治療組新生組織Masson染色顯示成熟骨組織膠原的分布較廣，說明LIPUS能夠促進新生牙槽骨中骨膠原合成，提高新生牙槽骨成熟度。

本研究通過組織形態(tài)學測量方法，評價LIPUS與GBR聯合應用對牙周骨缺損牙槽骨修復的作用。研究結果顯示LIPUS+GBR組較GBR組有更多的新生牙槽骨，統(tǒng)計學上具有顯著性差異，說明LIPUS對牙槽骨修復具有促進作用，但是LIPUS+GBR組新生牙槽骨量有限，僅占缺損總面積8.08％～12.52％，缺損區(qū)膠原纖維束較多，原因可能是：移植骨主要為皮質骨，骨細胞及成骨細胞含量少，自身成骨作用有限，主要起支架作用，引導附近相關細胞進入缺損區(qū)形成新骨，該修復早期表現可能為先吸收再修復，由于實驗時間只有4周，組織學反應主要表現為移植骨吸收。

4 結論

LIPUS輔助GBR治療，在一定程度上可以促進牙周骨開窗缺損的早期修復。后續(xù)研究可考慮GBR術中選擇適當的移植材料，比如牙周組織工程復合材料，通過組織工程支架直接引導成骨反應，以期進一步提高修復療效。

［1］吳鵬，宋錦璘，馮格，等.低強度脈沖超聲波對Beagle犬牙槽骨缺損的修復效應［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，2010，28（5）：522－525.

［2］孟煥新.牙周病學［M］（第.3版）.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：264－269.

［3］Keles GC，Sumer M，Cetinkaya BO，et al.Effect of autogenous corticalbone grafting in conjunction with guided tissue regeneration in the treatment of intraosseous periodontal defects［J］.Eur J Dent，2010，4（4）：403 －411.

［4］Sato N，編，王勤濤，譯.牙周外科學臨床圖譜［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：133－136.

［5］Becker W，Dahlin C，Becker BE，et al.The use of e-PTFE barrier membranes for bone promotion around titanium implants placed into extraction sockets：a prospective multicenter study［J］.Int J Oral Maxillofac Implants，1994，9（1）：31 －40

［6］Gher ME，Quintero G，Sandifer JB，et al.Combined dental implant and guided tissue regeneration therapy in humans［J］.Int J Periodontics Restorative Dent，1994，14（4）：332 －347

［7］何平，高翔，宋錦璘，等.低強度脈沖超聲波對Beagle犬Ⅱ度根分叉病變的輔助效應［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（7）：1219－1223.

［8］董妮，宋錦璘，馮格，等.低強度脈沖超聲波對Beagle犬牙周炎組織修復效應的初步研究［J］.四川大學學報（醫(yī)學版），2012，43（2）：183－187.

［9］李娜，盧禮，宋錦璘，等.低強度脈沖超聲波聯合牙周組織翻瓣移植修復Beagle犬骨上缺損型牙周病［J］.中國組織工程研究，2012，16（5）：766－769.

［10］劉婷，宋錦璘，劉珉懿，等.低強度脈沖超聲波對 Beagle犬下頜第三前磨牙慢性牙周炎組織學效應的探討［J］.中國超聲醫(yī)學雜，2011，27（11）：970－973.

［11］Ikai H，Tamura T，Watanabe T，et al.Low-intensity pulsed ultrasound accelerates periodontalwound healing afterflap surgery［J］.J Periodont Res，2008，43（2）：212－216.

［12］楊尊，任蕾西，宋錦璘，等.低強度脈沖超聲刺激對人類牙周膜細胞BMP-2表達效應的研究［J］.中國美容醫(yī)學，2011，20（5）：767－770.

［13］鄭鴻，盧禮，宋錦璘，等.低強度脈沖超聲波聯合引導組織再生術促進牙周骨開窗缺損修復的動物實驗［J］.中華口腔醫(yī)學雜志，2011，46（7）：431－436.

［14］Kobayashi Y，Sakai D，Iwashina T，et al.Lou-intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation，proteoglycan synthesis and expression of growth factor-related genes in human nuclesus pulposus cell line［J］.Eur Cell Mater，2009，17（3）：15 －22.

［15］Zimmerman WK.Periodontal repair in dogs：supraalveolar defect modelsforevaluation ofsafety and efficacy ofperiodontal reconstructive therapy［J］.Journal of Periodontology，1994，65（3）：1151－1157.

［16］Weinberg MA，Bral M. Laboratory animal models in periodontology［J］.J Clin Periodontol，1999，26（6）：335 －340.

［17］Hjorting-Hansen A.Incomplete bone healing of experimental cavities in dog mandibles［J］.British Journal of Oral Surgery，1971，9（1）：33－40.

［18］Caton J，Motal，Gandinil.Non-human primate models for testing the efficacy and safety of periodontal regeneration procedures［J］.J Periodontol，1994，65（12）：1143 －1150.

［19］Assaf A.Ridge splitting technique：a 3－D solution for the thin Maxilla［J］.Dental Horizons.2006，2（11）：7 －11.

［20］Ming Jiang，Ge Wang，Margaret W，et al.Blind Deblurring of Spiral CT Images.IEEE Trans［J］.Medical Imaging.2003，22（8）：837－845.

［21］Sun Juisheng，Hong RC，Chang W Hong-Shong，et al.In vitro effects of low-intensity ultrasound stimulation on the bone cells［J］.J Biomed Mater Res，2001，57（3）：449 －456.

［22］Inubushi T，Tanaka E，Rego EB，et al.Effects of ultrasound on the proliferation and differentiation of cementoblast lineage cells［J］.J Periodontal.2008，79（10）：1984 －1990.

［23］郭建剛，趙然，侯桂英，等.骨組織成分與Masson三色染色反應的關系分析［J］.中醫(yī)正骨，2001，13（11）：645－646.