陸海濱 李 彤 段大為 高文卿 于美麗 周淑芬 李金友 于廣棟

1（天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300203）2（天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170）3（天津市人工細胞重點實驗室，天津 300170）

引言

動脈微栓過濾器（arterial filter，AF）是體外循環(huán)（extracorporeal circulation，ECC）中用于濾除氣栓、脂肪粒等微小栓子的裝置，可以降低ECC相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)認知功能障礙［1］。濾網(wǎng)是AF的核心組件，多由滌綸、錦綸、尼龍等材料制成。

自ECC技術(shù)應(yīng)用于心臟手術(shù)以來，炎性反應(yīng)、濾網(wǎng)堵塞導(dǎo)致的剪切力過大破壞血液成分、循環(huán)流量減低、進血端壓力過高存在管路迸裂風(fēng)險等并發(fā)癥便成為亟待解決的問題。近年來，由于涂層材料的使用，上述與ECC相關(guān)的并發(fā)癥得到顯著改善［2－3］。

目前，國內(nèi)應(yīng)用的涂層ECC設(shè)備均為進口產(chǎn)品，主要應(yīng)用于ECMO轉(zhuǎn)流，價格昂貴，在常規(guī)手術(shù)中應(yīng)用受到限制［4］。而AF涂層單一，產(chǎn)品少，選擇空間小。由于結(jié)構(gòu)的特殊性，涂層AF不但要有良好的生物相容性，還要兼顧應(yīng)用安全等，但國內(nèi)外鮮有針對AF新型涂層的研究報道。

低分子肝素鈉（low molecular weight heparin，LMWH）是目前國外ECC設(shè)備中廣為應(yīng)用的一類涂層物質(zhì)，抗凝效果確切。海藻酸鈉是生物相容性良好的天然提取物，造價低廉，是藥物載體的理想材料。部分氧化后的海藻酸鈉（oxidized sodium alginate，OSA）表面有大量的活性醛基［5］，可以實現(xiàn)與改性后材料的共價結(jié)合。LMWH與OSA兩種不同涂層的濾網(wǎng)，可以在抗凝效果、材料成本以及擴展應(yīng)用方面滿足不同的要求。

為研究新型涂層材料，將現(xiàn)有國產(chǎn)未涂層的AF產(chǎn)品進行拆解，對其核心組件——滌綸（polyester，PET）材質(zhì)的濾網(wǎng)進行化學(xué)接枝改性，共價結(jié)合LMWH涂層和OSA涂層，并對涂層后材料的生物相容性和AF應(yīng)用安全性進行評價和比較。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

成人動脈微栓過濾器（東莞科威醫(yī)療器械有限公司）拆解后，將濾網(wǎng)裁剪為5 cm×2 cm；肝素鈉（分子量12 000～20 000，效價150 IU/mg，安徽金鑫生物），人血清白蛋白（Behring GmbH，德國），人血清纖維蛋白原（EMD Chemicals，德國）；聚乙烯亞（分子量60 000）、海藻酸鈉（分子量7 000～20 000）、亞硝酸鈉、高碘酸鈉等試劑均購自Sigma公司。

紅外分光光度計（NICOLET 6700，Thermo，美國），紫外分光光度計（UV-2800，日立，日本），凝血自動分析儀（STA-R Evolution?，Diagnostica Stago，法國），血細胞分析儀（ADVIA2120，SIEMENS，德國），BCA蛋白定量試劑盒（SK3021，上海生工），掃描電鏡（FEI臺式，美國）。

1.2 方法

1.2.1 材料表面改性與涂層制備

1.2.1.1 重氮化方法制備LMWH［6］

肝素鈉粉劑1 g充分溶解于去300 mL離子水中，并加入亞硝酸鈉10 mg，在0℃、pH=2.7條件下反應(yīng)2 h后，調(diào)定溶液pH值至7.0以中止反應(yīng)，得到LMWH溶液。用7 000 Da孔徑的透析袋將反應(yīng)后的溶液進行透析后冷凍，利用低溫真空干燥機進行干燥獲得LMWH粉末。

1.2.1.2 OSA的制備［5］

將海藻酸鈉4 g充分溶解于196 g去離子水中，并加入高碘酸鈉0.432 g，避光反應(yīng)24 h，加入乙二醇終止反應(yīng)，得到OSA溶液。向OSA溶液加入NaCl，混勻后倒入乙醇中，將析出物抽濾干燥后再次溶于去離子水中，用3 500 Da孔徑的透析袋進行透析，低溫真空干燥后獲得OSA粉末。

1.2.1.3 滌綸濾網(wǎng)表面改性與涂層修飾［7］

取200 mL質(zhì)量分數(shù)為30％的H2SO4，并加入0.948 g的K2MnO4，配制K2MnO4濃度為0.03 mol/L的H2SO4·K2MnO4溶液。如圖1所示，首先用H2SO4·K2MnO4溶液對PET材料進行預(yù)處理，氧化材料表面形成羧基（—COOH，a），充分清洗干燥后，在pH=9、室溫條件下與聚乙烯亞胺的氨基（—NH2，b）結(jié)合并構(gòu)建大量的“空間臂”，增加以氨基基團為主的結(jié)合位點，進而與LMWH或OSA末端的醛基（—CHO）結(jié)合，制成“終點固定”方式的共價鍵結(jié)合的涂層材料：LMWH涂層的PET濾網(wǎng)（LMWH組），OSA涂層的PET濾網(wǎng)（OSA組）。另有空白對照的未涂層濾網(wǎng)（PET組）。

圖1 高分子材料表面共價結(jié)合涂層的制備流程Fig.1 The flow chart of the coating material production.

1.2.1.4 整裝濾器的涂層修飾

整裝涂層濾器用于壓力、流量測定。將未拆解的AF接入閉合回路，在不同處理階段，依次預(yù)充H2SO4·K2MnO4溶液、PEI溶液、LMWH或OSA溶液，并維持轉(zhuǎn)流狀態(tài)；在每次更換預(yù)充液前、反應(yīng)結(jié)束后，使用去離子水反復(fù)沖洗。

1.2.2 材料表面涂層效果分析

1.2.2.1 材料表面涂層定性分析

分別制備LMWH與OSA對照樣品的溴化鉀壓片；待測濾網(wǎng)取1 cm2小片，用去離子水清洗3遍后干燥備用。利用紅外分光光度計對材料表面進行掃描，并與標準藥品的吸光度曲線進行對比。

1.2.2.2 LMWH定量檢測

材料表面LMWH涂層密度的測定采用甲苯胺藍定量方法，在參考文獻［8］中的方法建立標準曲線（見式（1））后，取10 cm2樣品，加入質(zhì)量分數(shù)0.02％的TBO、PBS各2.5 mL，震蕩混勻，室溫反應(yīng)50 min。利用紫外分光光度計，測量630 nm波長處的abs值，并根據(jù)標準曲線推算等價于肝素鈉標準品的涂層密度（見式（2））。

1.2.2.3 OSA定量檢測

材料表面OSA涂層密度的測定采用硫酸-苯酚多糖定量方法，在參考文獻［9］中的方法建立標準曲線（見式（3））后，留取制備涂層前后的OSA反應(yīng)液，用硫酸苯酚法處理后，用紫外分光光度計測量480 nm波長處的abs值，利用差值根據(jù)標準曲線推算等價于葡萄糖標準品的涂層密度（見式（4））。

1.2.3 生物相容性評價

1.2.3.1 表面接觸角測定

待測濾網(wǎng)適當修剪，充分干燥，通過微量進樣器在其表面滴加2 μL純水，用動態(tài)接觸角測量儀記錄接觸角不同時間點的變化。實驗數(shù)據(jù)由SCA 202軟件進行進一步分析。

1.2.3.2 涂層表面蛋白黏附檢測

涂層表面黏附蛋白性能的測試使用BCA蛋白分析試劑盒，觀察材料表面對人血清白蛋白及人血纖維蛋白原的黏附情況。參照說明書制作標準工作曲線（見式5），配制BCA工作液和0.2 mg/mL的蛋白稀釋液。將10 cm2樣品剪做碎片，加入1.5 mL蛋白稀釋液，將材料完全浸沒。置于恒溫水箱中，37℃孵育1 h。取反應(yīng)液100 μL，加入BCA工作液1 mL，在60℃恒溫孵浴30 min。利用紫外分光光度計在562 nm進行測定，根據(jù)標準曲線，推算反應(yīng)前后的蛋白量差值，即為材料表面的等價標準蛋白黏附量（見式（6））。

1.2.3.3 涂層表面血小板黏附測試

將健康志愿者全血以800 r/min離心10 min后，得到富血小板血漿，留樣測定血小板計數(shù)PLT1；取10 cm2樣品，剪成碎片，加入等量血漿，在37℃恒溫水箱孵浴2 h后再次測定血小板計數(shù)PLT2（見式7）。

血小板黏附率=（PLT1－PLT2）/PLT1（7）

1.2.3.4 體外抗凝活性檢測

抽取健康志愿者全血，3 000 r/min離心15 min，得到貧血小板血漿，留樣測定凝血指標PT、TT、FIB、APTT。取10 cm2樣品，剪成碎片加入等量血漿，在37℃恒溫水箱孵育2 h后，再次取樣測定凝血指標。

1.2.3.5 體外血栓形成試驗

將待測濾網(wǎng)30 cm2真空干燥后稱量干重W1，再將其置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，迅速加入新鮮未抗凝全血2 mL浸沒材料，37℃恒溫孵育60 min取出樣品。PBS沖洗3遍，3％戊二醛浸泡2 h，用梯度乙醇（體積分數(shù)分別為50％、60％、70％、80％、90％、98％）處理后低溫真空干燥，再次稱量干重W2，計算單位面積黏附量（見式（8）），并通過掃描電鏡觀察濾網(wǎng)表面血栓的形成情況。

1.2.4 應(yīng)用安全性能評價

1.2.4.1 表面涂層動態(tài)脫落檢測

以3只中空的未涂層濾器外殼作為容器，每組取100 cm2樣品修剪待測，放入不同濾器，出口處以未涂層濾網(wǎng)攔截，保證樣品不會脫出。連接體外循環(huán)機、泵管（30 cm），PVC管路（30 cm×2），預(yù)充PBS約250 mL。從轉(zhuǎn)流開始（0 h），在此后1、2、4、8、16、32、64 h的時間點抽取轉(zhuǎn)流液，OSA組采用硫酸苯酚法、LMWH組采用甲苯胺藍法進行定量，PET組用兩種方法定量。

1.2.4.2 流量及壓力測試

AF兩端連接帶有側(cè)孔的接頭，并接入閉合的離心泵為動力的環(huán)路，將壓力監(jiān)測儀與側(cè)孔連接。環(huán)路中預(yù)充聚明膠肽與生理鹽水（3∶1），測試不同轉(zhuǎn)速下的濾器進口端壓力、流量變化，計算流量/轉(zhuǎn)速比值。

1.3 統(tǒng)計方法

所有定量資料用“均數(shù)±標準差”表示，所得數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，用方差分析進行多組間比較，兩兩比較利用SNK-q檢驗，統(tǒng)計學(xué)差異檢驗標準P＜0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 材料表面涂層定量及定性分析

涂層物質(zhì)定量結(jié)果，LMWH組涂層密度等價于肝素鈉標準品（42.3±8.5）g/cm2，而OSA組涂層密度等價于葡萄糖標準品（111.0±15.0）μg/cm2。

紅外光譜可見圖2，LMWH標準品在3 400 nm附近出現(xiàn)強吸收峰，OSA標準品在3 350 nm處出現(xiàn)強吸收峰，均為醛基吸收峰。PTE材料在3 000～3 500 nm波長處無吸收跡象，而涂層后材料在3 000～3 500 nm的吸光度增加，與LMWH、OSA標準品特征吸收峰趨勢相同。

2.2 表面接觸角測定

從表1中可見，與PET組相比，涂層后材料與水的表面接觸角顯著減?。≒＜0.01）。與LMWH組相比，OSA組的接觸角更小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 材料表面蛋白吸附

從實驗中發(fā)現(xiàn)（見表1），材料對蛋白的吸附量與接觸角的大小有相同趨勢，PET組對纖維蛋白原有強烈的吸附傾向，對白蛋白也存在一定程度的吸附，而涂層材料表面的纖維蛋白原與白蛋白吸附量均顯著減少（P＜0.01），且OSA涂層表面的吸附蛋白少于LMWH涂層表面的吸附蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 材料表面接觸角與表面血清蛋白成分的黏附（n=6）Tab.1 The contact angle and absorption of serum protein to the surface（n=6）

2.4 涂層表面血小板粘附

與PET組相比，涂層后材料血小板黏附率顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。LMNH組血小板黏附率小于OSA涂層材料（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 涂層前后血小板粘附比較（n=6）Fig.3 Comparation of plateletad here to material surface（n=6）

2.5 凝血功能4項

凝血功能檢測發(fā)現(xiàn)，同接觸材料前凝血指標相比，血漿與 PET組接觸后，PT延長，APTT與 TT有不同程度的縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；血漿與LMWH組、OSA組接觸后，PT變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），APTT、TT延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與 LMWH組相比，OSA組對血漿APTT、TT影響較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而PT變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在不同條件下，血漿FIB變化均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見圖4）。

圖4 不同材料對凝血4項的影響（n=6）Fig.4 The effect of different material to coagulation indices

2.6 材料表面血栓形成實驗

如表2所示，在全血浸泡后，樣品的單位面積干重均有所增加。與涂層后材料相比，未涂層材料的質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），LMWH組與OSA組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。電鏡圖片顯示（見圖5），PET組濾網(wǎng)的網(wǎng)孔大量堵塞（見圖5（a）），甚至大面積地被血液成分覆蓋（見圖5（b）），而涂層材料濾網(wǎng)僅表面有少量異物，網(wǎng)孔仍然通暢（見圖5（c）～（d））。

表2 全血浸泡后各組干重變化（n=6）Tab.2 The dry weight variation of all groups after soak in blood

圖5 涂層前后材料表面血栓形成情況。（a）PET組（部分堵塞）；（b）PET組（嚴重堵塞）；（c）LMWH組（通暢）；（d）OSA組（通暢）Fig.5 The throm bus on the surfaces of different coating.（a）Group PET（partly blocked）；（b）Group PET（seriously blocked）；（c）Group LMWH（clear）；（d）Group OSA（clear）

2.7 涂層動態(tài)脫落檢測

在動態(tài)脫落檢測中（見表3），起始階段（0 h）轉(zhuǎn)流液中出現(xiàn)的涂層物質(zhì)較多，可能為材料表面的殘留反應(yīng)液，此后便趨于穩(wěn)定。在96 h的轉(zhuǎn)流過程中，轉(zhuǎn)流液中涂層物質(zhì)變化（約10％）無統(tǒng)計學(xué)差異，表明96 h內(nèi)兩種涂層材料均無顯著脫落，涂層結(jié)合牢固。

2.8 流量測試

在流量測試中，在轉(zhuǎn)速為350～1 200 r/min范圍內(nèi)，涂層后濾器較PET組在相同轉(zhuǎn)速下流量降低，流量/轉(zhuǎn)速（F/R）減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)速超過1 500 r/min后，各組間流量、流量/轉(zhuǎn)速差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表4）。涂層濾器之間的比較無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 涂層物動態(tài)脫落檢測（n=6）Tab.3 The loss of the coating during analog ECC（n=6）

表4 各組濾器不同泵速下的流量變化（n=6）Tab.4 The variation of flow with different rotate speed（n=6）

2.9 壓力測試

在壓力測試中，與PET組相比，涂層后濾器相同泵速下入口側(cè)壓力（P＜0.01）、跨濾器壓差（P＜0.05）有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；兩種涂層濾器間比較，相同泵速下入口側(cè)壓力、跨濾器壓力無顯著差異（見圖6）。

3 討論

體外循環(huán)是心外手術(shù)中生理功能出現(xiàn)紊亂的主要原因。Solberg的研究認為，ECC可能會引起廣泛、未知的不良反應(yīng)（比如凝血功能異常），并通過觸發(fā)一系列旁路最終發(fā)展為全身的炎性反應(yīng)；而過多的血小板黏附所導(dǎo)致的血小板減少，會導(dǎo)致術(shù)后的出血和恢復(fù)時間延長［10］。Gunaydin在回顧性分析中指出，這一系列反應(yīng)已經(jīng)被證實是血液和非生物相容性材料表面接觸所致，而材料的生物相容性涂層可以有效地改善這一狀況［11］。ECC的不良反應(yīng)可能受到多方面的影響：涂層物質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)、氣血接觸面、血流動力學(xué)，以及和血液接觸的異物表面（比如體外循環(huán)管路和AF）。在體外循環(huán)中，AF的主要功能就是減少潛在的微小氣栓和血栓。Hussaini等認為，由于動脈微栓過濾器在體外循環(huán)設(shè)備中占據(jù)較大的接觸面積，所以其生物相容性涂層對減輕術(shù)中的炎性反應(yīng)有重要作用［12］。AF和ECC中其他的部件有很大的不同，比如外殼和濾網(wǎng)的材料、濾網(wǎng)孔徑、預(yù)充量、最大血流比率、跨濾器壓力、涂層材料以及濾器的結(jié)構(gòu)對血流動力學(xué)的影響。生物相容性AF改善全身的炎性反應(yīng)主要通過涂層材料及方法、濾器設(shè)計影響血流動力學(xué)變化。

圖6 不同AF的流量-壓力曲線（n=6）。（a）入口側(cè)壓力；（b）跨濾器壓力Fig.6 The flow-pressure curve of different AF（n=6）.（a）The inlet pressure；（b）The trans-filter pressure

LMWH是臨床常用抗凝藥物，通過催化抗凝血酶Ⅲ與凝血酶X的反應(yīng)，實現(xiàn)抑制凝血過程的作用，并且避免了完整肝素抗凝所帶來的出血傾向和血小板減少等副作用［11］。目前，國外已有商品LMWH涂層設(shè)備的生產(chǎn)。OSA近年來廣泛用作藥物載體，關(guān)于其抗凝效果及抗凝機制尚不明確，但實驗中發(fā)現(xiàn)OSA涂層同樣具有抗凝活性。

由本研究可見，化學(xué)接枝改性的方法可以實現(xiàn)LWMH和OSA兩種涂層與材料表面的穩(wěn)固結(jié)合，顯著改善了滌綸濾網(wǎng)的生物相容性。從紅外光譜可見，涂層后材料與涂層物質(zhì)特征峰處出現(xiàn)變化，雖然水化醛基也在該位置有吸收峰存在，但由于PET樣品與涂層后樣品在相同條件下測試，結(jié)合定量數(shù)據(jù)及生物相容性結(jié)果，可以證實材料表面有涂層物質(zhì)存在。在生物相容性評價中，OSA涂層表面接觸角較LMWH涂層更小，說明OSA涂層具有更好的親水性，而相應(yīng)地，OSA涂層表面黏附的蛋白成分（尤其是纖維蛋白原）也較LMWH更少。LMWH涂層表現(xiàn)出更好的抗血小板黏附，以及凝血激活時間的顯著延長。Wan等采用等離子體技術(shù)處理滌綸材料，對其表面基團進行分析后推斷，CO基團的增加是材料表面親水性提高的主要因素之一［12］。而Zhu等研究認為，纖維蛋白原的疏水基容易與疏水性表面結(jié)合，引起構(gòu)象變化，進而刺激血小板黏附激活、凝血因子激活等一系列凝血發(fā)硬，但親水性材料表面形成的“調(diào)和膜”可以減少纖維蛋白原的附著，具有更好的血液相容性［15］。大量的活性醛基帶有負電荷，使得OSA涂層具有一定的抗栓性能。所以，完善涂層方法，提高涂層濃度，探索不同氧化程度的OSA活性，增加活性醛基數(shù)量，可能對改善OSA涂層的抗凝活性有一定的推動作用。兩種涂層濾網(wǎng)在全血成分接觸后，仍能保持網(wǎng)孔的通暢，這有利于血液成分的保護，可保證濾器使用的安全性、持久性。

在模擬ECC中，濾網(wǎng)轉(zhuǎn)流初始階段出現(xiàn)較多的脫落物質(zhì)，這可能與材料表面黏附的非共價結(jié)合的涂層物質(zhì)有關(guān)，但整個轉(zhuǎn)流液中脫落涂層的濃度十分穩(wěn)定，為抗凝管理的安全性提供了保障。Wendel總結(jié)了涂層技術(shù)認為，穩(wěn)定的涂層材料，將極大簡化心臟手術(shù)中的抗凝管理，且更為安全［16］。涂層后濾器進口側(cè)壓力的增加、流量/轉(zhuǎn)速比值的減小，可能與涂層后濾網(wǎng)的流體動力學(xué)變化有關(guān)，但壓力仍在濾器標注范圍內(nèi)，且遠低于上限220 mmHg。雖有統(tǒng)計學(xué)意義，但差異較小的跨濾器壓力對血液成分影響很小。流量數(shù)據(jù)并無明確指標，但變化不大，且常規(guī)轉(zhuǎn)速小，流量并無差異。經(jīng)測試可發(fā)現(xiàn)，跨濾器壓力、流量/轉(zhuǎn)速雖有變化，但并不影響AF在ECC中的應(yīng)用安全性。由于AF對纖維強度無明確要求，且電鏡下未見纖維表面出現(xiàn)裂痕等異常變化，轉(zhuǎn)流中無濾網(wǎng)破損，所以雖然未對纖維強度進行測試，但顯然涂層濾網(wǎng)適用于長時間、高流量轉(zhuǎn)流。

經(jīng)過評價與檢驗可以認為，LMWH與OSA兩種涂層的滌綸濾網(wǎng)都具有良好的生物相容性與應(yīng)用安全性，其不同的生物相容性特點可以適用于不同需要。作為藥物載體的OSA，成本低，易于獲取，組織相容性好，不但可以推進AF在常規(guī)心臟手術(shù)中的應(yīng)用，還具有更大的擴展空間，可用于制備復(fù)合涂層或應(yīng)用于需要有良好組織相容性的醫(yī)療設(shè)備中。

4 結(jié)論

本研究用化學(xué)接枝改性的方法制備了結(jié)合穩(wěn)定的LMWH涂層PET濾網(wǎng)和OSA涂層PET濾網(wǎng)，長時間轉(zhuǎn)流無顯著脫落。涂層后濾網(wǎng)的生物相容性顯著改善，與血液接觸后材料表面的蛋白黏附、血小板黏附顯著減少，并具有良好的抗凝活性，表面血栓形成減少，濾網(wǎng)通暢，說明涂層后濾器應(yīng)用的安全性能滿足使用要求。OSA涂層與LMNH涂層相比，抗凝活性要略差，但有較好的親水性，蛋白吸附量較少，可能會有更好的組織相容性，這有待于更多測試的驗證。而且，OSA涂層成本低廉，也有更廣闊的拓展空間。

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