楊磊磊，戴岳楚，董米連，朱 敏，林雪飛，廖 偉，梅 統(tǒng)

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一［1］，為研究大腸癌的發(fā)生發(fā)展的機制，國外已經(jīng)建立了大腸癌細胞株，細胞株經(jīng)過長期培養(yǎng)后，生物學特性會產(chǎn)生變異。而原代培養(yǎng)的細胞離體時間短，則與體內(nèi)狀態(tài)更相近，能很好地反映患者的疾病特征。關(guān)于大腸癌細胞原代培養(yǎng)方法國內(nèi)外已有較多的報道，但成功率很低［2］。2010年3月—2010年11月我們對60例大腸癌患者的腫瘤細胞進行原代培養(yǎng)，并對不同的培養(yǎng)方法加以改進。

1 材料與方法

1.1 標本 標本來自手術(shù)治療的60例大腸癌患者（男33例，女27例；年齡20～84歲），術(shù)前均未經(jīng)放射治療和抗腫瘤化學藥物治療。

1.2 主要試劑 胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma）、腫瘤細胞分離液、1640培養(yǎng)液、胎牛血清、0.14％臺盼藍染液（Sigma公司）、Giemsa染液、免疫細胞化學相關(guān)試劑。細胞原代培養(yǎng)主要試劑的配制見表1。

1.3 標本采集與處理 采用了兩種取材方法：（1）黏膜層法。打開腸腔，找到癌灶，冰冷生理鹽水沖洗干凈，找到癌細胞最豐富的部位。根據(jù)腫瘤大小切取1.5～2.5cm3大小的腫瘤組織，修剪并去除壞死組織及脂肪組織。聚維酮碘溶液浸泡2～3min，洗液A反復沖洗。（2）漿膜層法。不打開腸腔，聚維酮碘消毒，打開漿膜層、肌層，找到腫瘤細胞最豐富的部位取材，洗液A反復沖洗。將組織塊表面薄層剔除。

表1 細胞原代培養(yǎng)主要試劑的配制

1.4 大腸癌細胞分離與培養(yǎng) 組織塊法：（1）將組織塊切碎（0.5～1mm3），洗液B反復吹打，使碎塊充分分散。（2）移入15mL無菌離心管中。（3）1000r離心2min，移除上清液。（4）洗液B重懸，重復步驟（3）2次。（5）用吸管將組織碎塊移入25cm2預先用L-左旋多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)瓶中，加2mL預先配好的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶底朝上放入37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中2～4h，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。（6）絕對靜置12～24h，緩慢取出培養(yǎng)瓶補加培養(yǎng)液2mL，繼續(xù)培養(yǎng)。絕對靜置2d。（7）3d后小心取出培養(yǎng)瓶仔細觀察并將漂浮的碎塊去除，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

機械分離法：（1）同組織塊法的（1）～（4）。（2）將組織碎塊移入不銹鋼濾網(wǎng)中，研磨并收集研磨液于15mL無菌離心管中。（3）加入等體積的腫瘤細胞分離液。可見到分離液逐漸下沉，出現(xiàn)明顯的分層，上層是研磨液，下層是腫瘤細胞分離液。（4）2000r離心10min，取出離心管，可見明顯分層（3層）。收集中間層于另一個15mL無菌離心管中。（5）加入5～10mL洗液B，1000r離心5min，移除上清液。（6）用洗液B重懸，重復步驟（5）1次。（7）加入5mL培養(yǎng)液重懸。（8）將懸液移入25cm2預先用L-左旋多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。（9）絕對靜置24～48h，緩慢取出培養(yǎng)瓶觀察培養(yǎng)液顏色，判斷是否需要補加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

胰蛋白酶消化法：（1）同組織塊法的（1）～（4）。（2）將組織碎塊移入15mL無菌離心管中。加入3～5mL胰蛋白酶消化液，放入37℃恒溫振蕩箱中，不斷振蕩，每隔15min觀察1次，30min后每隔15min收集消化液。（3）1000r離心2min，移除上清液，收集細胞沉淀，用洗液A沖洗。（4）將收集的細胞沉淀用培養(yǎng)液重懸，置于4℃冰箱中，直至消化過程全部結(jié)束（組織碎塊充分彌散開為止）。（5）將細胞懸液通過無菌的不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液于15mL無菌離心管中。（6）同機械分離法（3）～⑼。

Ⅳ膠原酶消化法∶（1）同組織塊法的（1）～（4）。（2）將組織碎塊移入15mL無菌離心管中。加入3～5mLⅣ膠原酶消化液，放入37℃恒溫振蕩箱中，不斷振蕩，每隔20min觀察1次。直至消化過程全部結(jié)束（組織碎塊充分彌散開為止）。（3）將消化液連同組織碎塊一起移入不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液于15mL無菌離心管中。（4）同機械分離法（3）～⑼。

1.5 細胞成活率檢查 采用臺盼藍染料排斥實驗，其原理為活細胞能排斥染料，但細胞膜完整性破壞后，染料可彌散入細胞內(nèi)。取純化后的細胞懸液50μL加入等體積0.14％臺盼藍充分混勻。5min內(nèi)進行細胞計數(shù)及活性鑒定，死細胞著藍色，活細胞不著色。

1.6 傳代方法 每天觀察細胞的生長情況，每3d更新培養(yǎng)液，待細胞覆蓋瓶底70％～90％時可進行傳代。（1）去除培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加入含0.2％EDTA的0.1％的胰蛋白酶2mL。（3）見到部分細胞變圓并開始脫落，每隔2min收集脫落細胞于15mL離心管中，并向離心管中加入等體積培養(yǎng)液終止消化。（4）每次收集細胞后重新向培養(yǎng)瓶補加0.1％的胰蛋白酶1mL繼續(xù)消化，直至消化過程全部結(jié)束。（5）1000r離心5min，移除上清液。（6）加入10mL培養(yǎng)液重懸。吸取5mL分別移入2個25cm2預先用L-左旋多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)瓶中，即為P1代。（7）將培養(yǎng)瓶放入37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 大腸癌原代細胞的鑒定 細胞形態(tài)觀察，用瑞吉染色法染色并觀察細胞形態(tài)。細胞免疫學鑒定，用免疫細胞化學法分別檢測細胞角蛋白（cytokeratins，CK）及癌胚抗原CEA。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料結(jié)果分析采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞分離培養(yǎng)方法比較 如表2所示，黏膜層取材組優(yōu)于漿膜層取材組（P＜0.05）。膠原酶消化法優(yōu)于胰酶消化法（P＜0.05），胰酶消化法優(yōu)于機械分離法（P＜0.05），機械分離法與組織塊法差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其中膠原酶消化法是最優(yōu)的人類大腸癌細胞原代培養(yǎng)方法，細胞培養(yǎng)成功率達到66.7％。取材方法與分離培養(yǎng)方法對細胞培養(yǎng)成功率都有影響（P＜0.05）。

表2 大腸癌細胞分離培養(yǎng)方法的比較（n=60）

2.2 細胞培養(yǎng)結(jié)果及鑒定結(jié)果 細胞培養(yǎng)結(jié)果詳見圖1～圖5。瑞吉染色法，細胞核被染成紫紅色，細胞漿被染成藍色，細胞核大深染，核質(zhì)比增大（圖6）。免疫細胞化學檢測細胞角蛋白，細胞的胞漿被染成棕黃色，而陰性及空白對照則僅見胞核為蘇木素復染呈藍色，胞漿陰性（圖7）。癌胚抗原CEA檢測結(jié)果與相應患者組織標本免疫組化鑒定結(jié)果一致。

圖1 大腸癌原代細胞培養(yǎng)第1代

圖2 大腸癌原代細胞培第2代

圖3 大腸癌原代細胞培養(yǎng)第3代

圖4 大腸癌原代細胞培養(yǎng)第10代

圖5 大腸癌原代細胞培養(yǎng)第20代

圖6 大腸癌細胞原代培養(yǎng)第10d瑞吉染色

圖7 大腸癌細胞原代培養(yǎng)第10d細胞免疫化學檢測細胞角蛋白200×

3 討論

腫瘤細胞原代培養(yǎng)程序復雜，細胞生長受到溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、酸堿度等多種因素的顯著影響，細胞培養(yǎng)工作的各個環(huán)節(jié)都有嚴格的規(guī)定和要求。因此，要認真的摸索實驗條件，總結(jié)經(jīng)驗，這樣才能提高細胞培養(yǎng)的成功率。腫瘤細胞體外的成功培養(yǎng)關(guān)鍵在于腫瘤組織的選擇、雜細胞的排除、適宜的生存環(huán)境等幾個方面。由于大腸本身就是一個細菌生存的大容器，所以污染是大腸癌細胞培養(yǎng)中所必須克服的首要問題。因此我們主要從這幾個方面來進行討論。

3.1 大腸癌細胞分離培養(yǎng)方法的比較 膠原酶消化法適用較廣，成功率最高；胰酶消化法成功率僅次于膠原酶消化法，會影響細胞貼壁效果，長期培養(yǎng)效果不佳；機械分離法對標本要求較高，機械分離作用易使細胞受損，細胞成活率較低；組織塊法操作簡單，成本低，細胞成活率較低。

3.2 控制污染措施 在控制污染方面，不但要求所用器材、試劑都保持無菌，嚴格按照無菌操作的原則進行操作。我們還著重從以下幾個方面采取了進一步的控制污染措施：（1）術(shù)前清理腸道。（2）取材前清潔取材部位，冰冷生理鹽水反復沖洗，聚維酮碘消毒。（3）取材方法的改進。我們用了兩種取材方法，黏膜層法及漿膜層法。黏膜層法比漿膜層法直觀，在直視下取到的腫瘤細胞更豐富。但是黏膜層法需要打開腸腔增加了污染的可能。漿膜層法可以降低污染的可能，卻很難獲得足夠的腫瘤細胞。（4）取材后立刻用聚維酮碘浸泡2～5min。（5）分離過程中始終保持細胞在有抗生素的環(huán)境中進行。通過對抗生素的濃度進行對照研究，配制出了含不同抗生素濃度的洗液A、B以及消化液A、B。取得了良好的效果。（6）培養(yǎng)基中加入適量抗生素也可有效防止污染。通過對照研究配制出含抗生素的培養(yǎng)液。

3.3 腫瘤組織的選擇 （1）挑選術(shù)前未經(jīng)過任何放化療的患者作為實驗對象。（2）腫瘤組織足夠大（＞2cm3），保證能夠獲得體積＞1cm3的組織。（3）在腫瘤細胞豐富的部位取材。（4）避開壞死區(qū)及脂肪組織較多的部位。（5）為了保證細胞成活率，還要注意取材要快。最好在腫瘤組織離體30min內(nèi)開始實驗。（6）為了防止腫瘤細胞發(fā)生自溶或凋亡，在成功接種腫瘤細胞前要保持腫瘤細胞始終在4℃的環(huán)境中。

3.4 雜細胞的排除 （1）取材前避開壞死及脂肪組織，取材后仔細修剪。（2）腫瘤細胞分離過程中加入腫瘤細胞分離液，可以獲得較純的腫瘤細胞。（3）成纖維細胞的清除。我們采用胰酶消化法來清除成纖維細胞，利用了不同細胞對胰酶的敏感性不同，成纖維細胞首先被消化下來，從而獲得了較純的腫瘤細胞。小鼠結(jié)腸上皮細胞在5％的血清濃度條件下生長良好，并且可在一定程度上抑制成纖維細胞的生長。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)大腸癌腫瘤細胞在5％的血清濃度條件下生長非常緩慢，而在20％的血清濃度條件下生長良好。（4）雜細胞清除時間的選擇。國外許多學者的經(jīng)驗表明，當腫瘤組織塊貼壁后，其癌細胞成片的生長，形成集落，常常抑制了雜細胞的生長，但也存在少量的雜細胞。根據(jù)這個結(jié)論，可以暫不對貼壁的細胞進行消化清除雜細胞，而是在第一次傳代時進行。

3.5 培養(yǎng)條件 （1）為了促進細胞生長，我們對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，在1640培養(yǎng)基中加入了可以促進細胞生長的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白。小劑量的胰島素可刺激細胞的生長，而過大則可能使細胞處于一種“饑餓狀態(tài)”，反而抑制其生長。我們在培養(yǎng)液中加入了0.5μg/mL的胰島素，細胞生長良好。（2）原代細胞培養(yǎng)貼壁比較困難，在分離獲得分散細胞并接種后要保持培養(yǎng)瓶絕對靜置2～3d，以免過早晃動導致細胞脫落。文獻報道，有用小鼠胚胎肺成纖維細胞-3T3細胞作為滋養(yǎng)層提高細胞的接種效率，也有用自制鼠尾膠原鋪制培養(yǎng)瓶來促進細胞貼壁。需要注意的是，在鼠尾膠原的制備過程中，由于鼠尾膠原為黏度較大的半透明液體，難以濾過除菌，整個制備過程需嚴格無菌，增加了污染的機會。我們采用了多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶法及血清包被培養(yǎng)瓶法，收到了良好的效果，而且操作簡單。還應注意，在用胰酶消化法分離培養(yǎng)細胞時，要分次消化收集消化下來的細胞，這樣可以縮短細胞與胰酶直接接觸的時間，減少胰酶對細胞的損傷，使貼壁更容易。同樣在第一次傳代時，由于原代細胞生長緩慢，第一次傳代時往往細胞已經(jīng)生長了2周左右，消化非常困難，也要注意用分次消化法，以免消化時間過長導致貼壁困難。

3.6 細胞分離培養(yǎng)方法比較 （1）組織塊法方法簡便、有效、成本低，但是雜細胞較多。組織塊法需注意剪碎的組織塊大小要適宜，如果過大，組織塊邊緣貼壁不良細胞溢出減少；如果過小，則因剪切過度而使細胞受損。在加液時一定要小心，以免沖散剛貼壁的組織塊，導致重新漂浮，而影響成活。（2）機械分離法操作簡單、成本也比較低，但是機械分離需要研磨組織，產(chǎn)生大量的細胞碎片影響正常細胞的生長。我們用了腫瘤細胞分離液去除了細胞碎片，但是研磨還導致大量的細胞受損，收集到的細胞活性很低，因此成功率很低（18.3％）。（3）胰酶消化法，取決于不同的細胞對胰酶消化的敏感性，關(guān)鍵是消化時間不易把握，時間過短獲得的腫瘤細胞數(shù)量不夠，時間過長影響細胞貼壁。成功率相對較高（41.7％）。（4）膠原酶消化法是細胞原代培養(yǎng)比較成功的方法，國外報道成功率在50％～60％［3］。我們在Simon P等［4］人方法的基礎上進行了改進，建立了較為合理、高效、穩(wěn)定的短期大腸癌細胞原代培養(yǎng)模式，即通過黏膜層取材，優(yōu)化后的膠原酶消化法，使人類大腸癌細胞原代培養(yǎng)成功率提高到66.7％。

［1］Saunders M，Iveson T.Management of advanced colorectal cancer：state of the art［J］.Br J Cancer，2006，95（2）：131～138.

［2］Dangles-Marie V，Pocard M，Richon S，et al.Establishment of hu?man colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts：comparison of success rate and cell line features［J］.Cancer Res，2007，67（1）：398～407.

［3］Alessandra Failli1，Rita Consolini1.The challenge of culturing hu?man colorectal tumor cells：establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches［J］.Tu?mori，2009，95（3）：343-347.

［4］Simon P.Cancer cell culture：methods and protocols［M］.New Jer?sey Humana Press，2004：79-93.