劉金良，伏建國(guó)，楊曉軍，安榆林，駱嘉言

進(jìn)口針葉木木材的DNA提取與分子鑒定方法

劉金良1，伏建國(guó)2，楊曉軍2，安榆林2，駱嘉言1

（1.南京林業(yè)大學(xué) 木材工業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京210001）

我國(guó)每年從國(guó)外進(jìn)口大量的針葉木材，這些材種的正確識(shí)別對(duì)于保護(hù)我國(guó)進(jìn)口商利益及消費(fèi)者合法權(quán)益等方面具有重要意義。由于木材形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)的局限性，近年來(lái)，分子遺傳學(xué)技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于木材的材種鑒定及來(lái)源地識(shí)別。選取進(jìn)口的6類針葉木木材為材料，研究木材DNA提取和純化方法，摸索出了適合于針葉木木材的CTAB-SDS-磁珠相結(jié)合的DNA提取和純化體系。擴(kuò)增出500 bp 的trnL內(nèi)含子片段，共發(fā)現(xiàn)85個(gè)堿基多態(tài)性位。聚類分析結(jié)果可以將6類進(jìn)口針葉木區(qū)分開(kāi)來(lái)，為進(jìn)口針葉木的鑒定及分子識(shí)別研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

針葉木木材； DNA提取；純化；PCR；trnL；鑒定

木材識(shí)別技術(shù)對(duì)于木材的合理使用、生產(chǎn)加工、打擊非法采伐、保護(hù)珍稀瀕危材種、規(guī)范市場(chǎng)秩序、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益等方面具有重要意義[1]。隨著世界木材消費(fèi)量的快速增長(zhǎng)，木材資源的短缺和匱乏日益顯現(xiàn)，非法砍伐和貿(mào)易嚴(yán)重破壞了林木資源的可持續(xù)利用。為了保護(hù)森林資源，很多國(guó)家出臺(tái)了保護(hù)森林的法規(guī)和政策，對(duì)木材的合法性提出了要求，如美國(guó)的《雷斯法案》（2008年修訂案）要求，所有輸美的木制品都應(yīng)提供木材供應(yīng)的合法來(lái)源，包括使用的植物種類的拉丁名、采伐的國(guó)家、數(shù)量、價(jià)值等[2]，這對(duì)木材識(shí)別技術(shù)提出了更高的要求。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法只能鑒定木材的種類（通常鑒定不到種的水平），無(wú)法識(shí)別木材的來(lái)源。

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記及DNA條形碼技術(shù)[3-7]逐漸成為一種物種輔助鑒定的工具，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始嘗試?yán)煤怂嵝蛄械牟町悂?lái)識(shí)別木材[8]。目前，很多實(shí)驗(yàn)在木材DNA提取領(lǐng)域取得了成功，從干燥或處理過(guò)的木材中獲得了可以滿足短片段核酸序列PCR擴(kuò)增的DNA[9-15]，也有少數(shù)通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)了木材種類的鑒定或來(lái)源地的驗(yàn)證[16-20]。雖然這些研究?jī)H限于試驗(yàn)的少數(shù)樹(shù)種，但其證明了分子遺傳學(xué)技術(shù)在材種識(shí)別領(lǐng)域應(yīng)用的可行性及其光明前景。

我國(guó)每年從美國(guó)、加拿大、俄羅斯等國(guó)進(jìn)口大量的針葉木，這些材種的正確識(shí)別鑒定對(duì)于保護(hù)我國(guó)進(jìn)口商利益、保護(hù)我國(guó)消費(fèi)者合法權(quán)益等方面意義重大。由于木材的形態(tài)鑒定需要具有豐富經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)專家，目前這些技術(shù)人才十分缺乏。本研究擬通過(guò)對(duì)進(jìn)口的針葉木木材DNA提取及分子鑒定技術(shù)進(jìn)行研究，建立適合于針葉木木材DNA提取的方法體系，通過(guò)初步的識(shí)別試驗(yàn)，探索分子識(shí)別的方法，為針葉木木材分子鑒定及來(lái)源地識(shí)別的研究工作打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料取自江蘇太倉(cāng)港口進(jìn)口的針葉木，樣品經(jīng)南京林業(yè)大學(xué)和太倉(cāng)出入境檢驗(yàn)檢疫局鑒定為花旗松Pseudotsuga menziesii、鐵杉Tsuga spp.、 冷 杉 Abies spp.、 云 杉 Picea spp.、 落 葉 松Larix spp.和輻射松Pinups radiata，樣品的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用材料的信息Table 1 Information of tested materials

1.2 DNA提取

DNA提取采用CTAB-SDS法，參考Novaes[21]等從豆科樹(shù)皮中提取DNA的方法，在其基礎(chǔ)上略有改變，具體操作步驟如下：

(1) 用手術(shù)刀削取約150 mg去除污染的木材削片，加入液氮，在低溫破碎儀（Retsch MM400）上研磨4 min，頻率30次/s；

(2) 迅速將粉末移入2 mL離心管中，加入900 μL 2% CTAB 溶液、0.02 g PVP、20 μL 巰基乙醇、2 μL 蛋白酶 K(20 mg/mL)，混勻后加入 35 μL 20%SDS，再次充分混勻；

(3) 在65℃水浴鍋中水浴過(guò)夜，其間多顛倒混勻幾次；

(4) 冷卻至室溫，加入900 μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻5 min；

(5) 用小型高速離心機(jī)離心20 min，13 000 r/min，吸取上清液至新的離心管中；

(6) 加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，離心20 min，13 000 r/min，吸取上清液至新的離心管中；

(7) 加入 140 μL 10% CTAB 溶液和 280 μL 5 mol NaCl溶液，顛倒混勻，然后離心20 min，13 000 r/min，吸取上清液至新的離心管中；

(8) 重復(fù)步驟 6；

(9) 加入等體積冷凍的異丙醇，輕輕晃動(dòng)，然后-20℃冷凍沉淀DNA 過(guò)夜；

(10) 13 000 r/min離心20 min，棄上清液；

(11) 用2 mL冷凍70%乙醇溶液洗滌沉淀2次；

(12) 在超凈工作臺(tái)上晾干，加入50 μL TE溶液溶解DNA，-20℃儲(chǔ)藏

1.3 DNA純化

采用GenMagBio公司的植物DNA磁珠純化試劑盒，詳細(xì)操作步驟如下：

(1)取50 μL DNA溶液于1.5 mL離心管中，加入等體積無(wú)水乙醇和20 μL磁珠，顛倒混勻10 min；

(2)將離心管置于磁力架1 min，使管內(nèi)磁珠被吸附，用移液器移走管內(nèi)液體，取下離心管；

(3)加入500 μL Wash BufferⅠ，顛倒混勻數(shù)次，將磁珠團(tuán)打散即可，利用磁力架吸附磁珠，1 min后移走管內(nèi)液體，取下離心管；

(4)重復(fù)步驟3，將磁珠團(tuán)打散即可，利用磁力架吸附磁珠，1 min后移走管內(nèi)液體，同時(shí)保持離心管置于磁力架上，使磁珠繼續(xù)被吸附；

(5)從離心管另一側(cè)緩慢加入550 μL Wash BufferⅡ，1 min后移走管內(nèi)液體，取下離心管；

(6)加入50 μL Elution Buffer，使磁珠重新懸浮，55℃溫浴10 min，其間輕輕晃動(dòng)使核酸充分洗脫；

(7)將離心管置于磁力架上1 min，使磁珠被吸附，將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，即為純化后的DNA溶液。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)Genbank上已發(fā)表的松科樹(shù)種序列進(jìn)行比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體tRNALeu(trnL)內(nèi)含子在不同種屬間的存在較為明顯的差異，因此選取trnL片段的一對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。正反向引物分別為trnL-F CGAAATCGGTAGACGCTACG和trnL-R GGGGA TAGAGGGACTTGAAC。擴(kuò)增采用Takara公司的Premix Ex Tag 混合酶液，50 μL 反應(yīng)體系，Premix Ex Tag 混合酶液 25 μL，模板 DNA 2 μL，正反向引物各1 μL，雙蒸水（ddH20）21 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，50℃ 1 min,72℃ 1 min, 循環(huán)30次，72℃延伸10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與測(cè)序分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，加入8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，150 V 電泳30 min，溴化乙錠中染色30 min，放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。擴(kuò)增出清晰條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工和南京金斯瑞生物科技有限公司純化后測(cè)序，測(cè)序引物采用PCR擴(kuò)增引物，所有序列均進(jìn)行雙向測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果首先進(jìn)行手工判讀和校對(duì)，然后用DNA Star軟件包中的SeqMan拼接。所得序列導(dǎo)入Mega 5軟件，使用Clustal W多序列對(duì)比功能進(jìn)行對(duì)位排序?？瘴惶幾魅笔顟B(tài)。對(duì)位排序后的序列用軟件中的鄰接法(Neigobor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)用自展(Bootstrap)分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，循環(huán)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

提取純化后的DNA經(jīng)Spectrophotometer定量法檢測(cè)，DNA得率及OD260/280值見(jiàn)表2，利用CTAB-SDS-磁珠提取法，從不同材種獲得的DNA質(zhì)量差別明顯，從花旗松中提取的DNA質(zhì)量最低，平均每1 g 木材獲得 DNA 4.74 μg，OD260/280的值也較低。從 中獲得的DNA質(zhì)量最高，平均每1 g 木材獲得 DNA 25.72 μg，OD260/280 的值也較為理想。

表2 從不同材種中提取的DNA質(zhì)量Table 2 DNA recovered from different woods

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，30個(gè)樣品共擴(kuò)增出29個(gè)約500 bp大小的目標(biāo)條帶，只有一個(gè)鐵杉樣品未擴(kuò)增出條帶，擴(kuò)增成功率為96.7%，未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，但有些目標(biāo)條帶較為模糊。

圖1 6類針葉木木材trnL片斷PCR結(jié)果電泳圖M:marker DL2000； L(1-6)：落葉松；Y(1-4)：云杉；A(1-4)：落葉松；F(1-4)：輻射松；H(1-6)：花旗松；T(1-6)：鐵杉；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照Fig. 1 PCR amplification results of trnL partial sequences of six conifer wood

2.3 測(cè)序結(jié)果分析

圖2 6類針葉木木材trnL內(nèi)含子部分片段序列L(1-6):落葉松；Y(1-4):云杉；A（1-4）：落葉松；F（1-4）：輻射松；H（1-6）：花旗松；T（2-6）：鐵杉；Fig. 2 Partial sequences of the trnL intron of six conifer wood

29個(gè)PCR產(chǎn)物全部測(cè)出500 bp左右的DNA序列（見(jiàn)圖2），其中花旗松6條，鐵杉5條，落葉松6條，云杉4條，冷杉4條，輻射松4條。測(cè)序結(jié)果在Genbank上進(jìn)行比對(duì)，全部與已經(jīng)發(fā)表的同屬trnL基因片斷具有99%的相似度，證明本實(shí)驗(yàn)提取的DNA確是相應(yīng)種類針葉木的DNA。在500 bp的序列中共發(fā)現(xiàn)85個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，可以將6類針葉材完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。所得序列導(dǎo)入Mega 5軟件，使用Clustal W多序列對(duì)比功能進(jìn)行對(duì)位排序，空位處作缺失狀態(tài)，對(duì)位排序后的序列用軟件中的鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示，花旗松、落葉松、鐵杉、冷杉、云杉和輻射松分別以自展值99、97、100、100、100、100聚為一支，和形態(tài)學(xué)分類鑒定的結(jié)果一致。

圖3 基于葉綠體trnL部分序列構(gòu)建的6屬針葉木系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系NJ樹(shù)Fig. 3 NJ tree of six kinds of conifer wood based on trnL region of chloroplast DNA

3 結(jié)論與討論

針葉木中含有很多影響DNA提取及抑制PCR擴(kuò)增的物質(zhì)，從針葉木中提取DNA是非常困難的[22]。 2004年Reynolds[12]利用試劑盒法從松木中提取出可以擴(kuò)增出400 bp的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)最初采用改良的CTAB及試劑盒法，均未獲得滿意的結(jié)果。最后選用CTAB-SDS方法進(jìn)行提取，后用磁珠法進(jìn)行純化，從6類針葉材中獲取的DNA96.7%能夠擴(kuò)增出500 bp的片段，證明了該方法適合于針葉木DNA的提取。未經(jīng)磁珠純化的木材DNA含有較多的抑制PCR擴(kuò)增物質(zhì)，將其與同體積的陽(yáng)性對(duì)照DNA混合后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的條帶明顯比陽(yáng)性對(duì)照與同體積水混合后擴(kuò)增出的條帶暗。利用磁珠純化后，上述抑制現(xiàn)象不明顯。

葉綠體trnL片段是植物DNA條形碼的候選片段之一[15]，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其在針葉木屬間差異明顯，通過(guò)聚類分析很容易將進(jìn)口的6類針葉木材種區(qū)分開(kāi)來(lái)。在Genbank上比對(duì)的結(jié)果顯示，同屬的樹(shù)種，該段序列大多具有99%的相似度，而與其它屬的序列相似度則較低，又由于500 bp片段相對(duì)較短，適合于木材DNA的擴(kuò)增。因此，trnL是用于進(jìn)口針葉木材種鑒定較為理想的片段。

本研究從6類進(jìn)口針葉材中提取出可用于普通PCR擴(kuò)增的DNA，為后繼的木材DNA提取、分子識(shí)別等研究工作提供了些許借鑒。利用trnL片段成功地將6類針葉木區(qū)分開(kāi)來(lái)，這一技術(shù)可作為形態(tài)鑒定的輔助手段，直接應(yīng)用于進(jìn)口木材的檢驗(yàn)鑒定。但由于本實(shí)驗(yàn)樣品有限，提取方法能不能適應(yīng)于更多種類針葉木DNA的提取還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，trnL序列目前只能將針葉木區(qū)分到屬的水平，更精確的識(shí)別還需要進(jìn)一步的研究。

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DNA extraction from imported coniferous tree wood and identification technology based on molecular genetic tools

LIU Jin-liang1, FU Jian-guo2, YANG Xiao-jun2, AN Yu-lin2, LUO Jia-yan1
(1. College of Wood Science and Technology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;2. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People’s Republic of China, Nanjing 210001, Jiangsu, China )

China imported large quantities of conifer wood every year. The correct identification of the wood had a very important significance to protect the interests of importers and consumers. Molecular genetic tools had been used to the wood identification in recent years because the morphological methods had their limitations. Six kinds of conifer wood imported from different countries were selected, the wood’s DNA extraction and purification methods were studied, and a technique system that combined CTAB, SDS and magnetic beads, is suitable for conifer wood has been put forward. The trnL intron fragment of 500 bp was amplified and sequenced,a total of 85 single nucleotide polymorphisms were found, so the 6 kinds of conifer wood could be distinguished. The success of DNA identification and PCR amplification of conifer wood would be very helpful to further study.

conifer timber; DNA extraction; purification; PCR; trnL; identification

S781.1；Q341

A

1673-923X (2012)08-0131-06

2012-02-25

國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目“進(jìn)出口珍稀瀕危材種檢驗(yàn)鑒定技術(shù)的研究”（2008IK237）

劉金良(1986—)，男，研究生；主要從事木材樹(shù)種鑒定研究

安榆林，男，研究員；主要從事入境植物檢疫工作；E-mail:anyl@jsciq.gov.cn

[本文編校:邱德勇]