李安平，謝碧霞，沈 偉，蔣雅茜

橡實(shí)淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精專用酵母菌株的篩選

李安平1,2，謝碧霞1，沈 偉1，蔣雅茜1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

從栓皮櫟自然發(fā)酵基質(zhì)中分離得到的36株酵母菌，經(jīng)TTC 平板顯色圖變化挑選出5株菌株，分別測試比較其發(fā)酵性能。結(jié)果表明：篩選的5株酵母菌菌落形態(tài)基本一致，但酵母菌XS03和XS04的死亡率顯著低于XS01、XS02和XS05等3株酵母菌（P＜0.05）的死亡率；在酒精濃度低于6%時(shí)，酵母菌XS03和XS04比酵母菌XS01、XS02和XS05等具有更高的耐酒精能力和耐高塘能力；發(fā)酵36 h后酵母XS03和XS04的失重率和出酒率顯著高于XS01、XS02和XS05等3種菌種（P＜0.05）。

橡實(shí)淀粉；發(fā)酵；酵母菌株；篩選

能源是國家重要的戰(zhàn)略性資源，但化石能源存在一定的污染性和有限性，因此，人們逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到可再生和低污染的燃料酒精能源方面[1]。但以糧食為原料的高生產(chǎn)成本又阻礙了燃料酒精的發(fā)展[2]。燃料酒精主要采用發(fā)酵法生產(chǎn)，而酵母菌株是影響發(fā)酵法中淀粉出酒率和酒精發(fā)酵質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[3]。不同的發(fā)酵原料需要不同酒精耐受性的高產(chǎn)酵母菌株。篩選性能優(yōu)異的酵母，不僅可以提高酒精發(fā)酵質(zhì)量和淀粉出酒率，而且能降低原料消耗及生產(chǎn)成本[4]。

橡實(shí) acorn，又稱為橡子，是殼斗科Fagaceae植物果實(shí)的通稱，分布區(qū)域極廣[5]。我國約有橡實(shí)300余種，估計(jì)橡實(shí)年產(chǎn)量有60～70億kg，然而大部分橡實(shí)并沒有得到利用[6]。橡實(shí)種仁中淀粉含量約為50%～70%，是良好的淀粉質(zhì)原料[7]，因此，以橡實(shí)為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精是較好的利用途徑。在眾多橡實(shí)品種中，栓皮櫟產(chǎn)量較高，且具有典型橡實(shí)品種特征，因此選擇以栓皮櫟為例進(jìn)行研究。本研究從栓皮櫟自然發(fā)酵基質(zhì)中分離出一些具有較高酒精耐受性能的酵母菌,并對(duì)該菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行初步研究，期望能為燃料酒精的工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 原材料

栓皮櫟Quercus variabilis Blume，采自湖南南岳衡山。

1.2 設(shè)備與儀器

SHP-150型生化培養(yǎng)箱、DL-6M/DL-6MI大容量冷凍離心機(jī)、島津UV1700 分光光度計(jì)。

1.2.1 培養(yǎng)基[8]

富集培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，酵母膏0.05 g，KH2PO40.25 g，尿素 0.1 g，，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)e2(SO4)30.01 g，孟加拉紅（1%的水溶液），加蒸餾水至100 mL，用H2SO4調(diào)節(jié)pH至4.5，115℃溫度下高壓滅菌15 min。

分離純化培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，酵母浸膏0.8 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂1.5 g，用蒸餾水定容至100 mL，培養(yǎng)基pH值用H2SO4調(diào)節(jié)至4.5，115 ℃溫度下滅菌15 min，冷卻后倒平板備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15.0 g，酵母浸膏0.5 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，蛋白胨 0.5 g，KH2PO40.1 g, 用蒸餾水定容至100 mL，培養(yǎng)基pH值用H2SO4調(diào)節(jié)至4.5，115 ℃溫度下滅菌15 min。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)分離[9]

將新鮮栓皮櫟樣品粉碎后置于發(fā)酵瓶中讓其自然發(fā)酵。待栓皮櫟發(fā)酵基質(zhì)在發(fā)酵瓶中有大量氣泡產(chǎn)生時(shí)，取發(fā)酵醪液10 mL置于100 mL 酵母富集培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)約20～24 h，然后取發(fā)酵液梯度稀釋，平板涂布，每一梯度做3個(gè)平行，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將具有典型酵母菌落形態(tài)的菌落用竹簽在麥芽汁培養(yǎng)基平板上劃線分離，直至單菌落出現(xiàn)，然后鏡檢，挑選純單菌落，接種于麥芽汁試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)12 h后，于4℃冰箱中冷藏備用。

1.3 酵母菌種的篩選[10]

初篩選：由菌落的顏色可初步判定酵母產(chǎn)酒精的能力，因此挑選具有紅色特征的菌落作為初篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

復(fù)篩選：將初篩選出的菌株經(jīng)活化后接入酒精濃度分別為0%、3%、6%、9%(V/V)的富集培養(yǎng)基中，于溫度為28 ℃的搖床上培養(yǎng)，每間隔2 h測定1次培養(yǎng)基的吸光度OD560，然后繪制酵母的生長曲線。通過比較酵母菌在不同酒精濃度下的生長情況篩選具有較好酒精耐受性的菌株。

1.4 酵母發(fā)酵性能測試[11]

將篩選酵母置于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)發(fā)酵性能測試。在酵母的發(fā)酵周期內(nèi)定時(shí)取樣測定發(fā)酵醪液中的pH 值、糖度、吸光度OD560和酒精度。初始酒精濃度用無水乙醇調(diào)節(jié)，初始糖度用固體葡萄糖調(diào)節(jié)。

1.5 酒精濃度的測定[12]

取100 mL發(fā)酵醪液置于500 mL的蒸餾瓶內(nèi)，加蒸餾水100 mL，然后加熱蒸餾，直至餾出100 mL溶液，用酒精比重計(jì)測定其酒精度，同時(shí)測定此時(shí)的溫度，將測得的酒精度換算為20 ℃時(shí)的酒精濃度。

1.6 各酵母菌株的橡實(shí)淀粉出酒率比較實(shí)驗(yàn)[13-15]

用帶發(fā)酵栓的500 mL磨口三角瓶裝入溶解了60 g栓皮櫟淀粉的300 mL發(fā)酵溶液，然后在溫度28 ℃、起始pH為4.5的條件下接入不同酵母菌株發(fā)酵。觀察5株酵母菌株在帶發(fā)酵栓的磨口三角瓶中發(fā)酵情況，分別測定12 h、24 h、36 h、48 h和60 h 的CO2失重率（失重率=某時(shí)刻CO2失重量/溶液總重量），并測定成熟發(fā)酵醪的淀粉出酒率[原料出酒率（%）=酒精產(chǎn)量（mL）×95%/原料耗用量（g）]。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離和純化所得酵母菌的形態(tài)特征比較

通過富集培養(yǎng)、分離、鑒定和純化等的比較篩選，從橡實(shí)發(fā)酵基質(zhì)中分離得到36株具有典型酵母菌菌落特征的菌株，結(jié)合0.1%的TTC 平板顯色圖變化挑選出5株菌株，分別編號(hào)為XS1-5。經(jīng)2～3次活化，接種于橡實(shí)淀粉基質(zhì)中培養(yǎng)24 h，觀測菌落形態(tài)、大小、出芽率和死亡率。結(jié)果見表1。

表1 酵母菌的形態(tài)特征比較Table 1 Comparison of morphological characteristics of yeasts

從培養(yǎng)狀況的觀測表明，篩選的5株酵母菌菌落形態(tài)基本一致，為圓形，低凸起，邊緣整齊，不透明，表面光滑，閃光，乳白色，蠟狀。酵母菌個(gè)體普遍較大且均勻，基本尺寸在5.0～8.2×5.0～10.0 μm之間，其死亡率較低，出芽率較高。5株酵母菌相比較，XS03、XS04的死亡率顯著低于XS01、XS02和XS05等3菌株（P＜0.05）。

2.2 各酵母菌株耐酒精能力比較

將經(jīng)初篩選獲得的5株長勢較好的酵母菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，比較它們在酒精濃度(V/V)分別為0%、3%、6%、9%條件下的生長情況。結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 0%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of yeasts with 0% alcohol concentration

圖2 3%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of yeasts with 3% alcohol concentration

圖3 6%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of yeasts with 6% alcohol concentration

圖4 9%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.4 Growth curves of yeasts with 9% alcohol concentration

從圖中可以看出，在初始發(fā)酵液中酒精濃度(V/V)為0的情況下，發(fā)酵時(shí)間不超過72 h時(shí)，5種發(fā)酵酵母的生長情況基本一致；當(dāng)超過72 h時(shí)，酵母XS03和XS04的生長明顯快于其它3種酵母，此時(shí)酵母XS01、XS02和XS05的生長幾乎完全停滯。當(dāng)初始發(fā)酵液酒精濃度為3%和6%時(shí)，發(fā)酵時(shí)間不超過48 h，5株菌株的生長基本一致，但超過48 h后，XS3和XS4有著較強(qiáng)的酒精耐受性，其生長顯著快于其它3種菌株。當(dāng)初始發(fā)酵液酒精濃度為9%，5種菌株從發(fā)酵開始即受到了抑制，生長均非常緩慢。5種酵母菌株的酒精耐受能力比較表明，XS3和XS4比其它3種菌株具有更強(qiáng)的耐受酒精能力。

2.3 各酵母菌株耐高糖能力比較

將5種篩選的酵母菌接入初始糖度分別為5 Brix、10 Brix、20 Brix、30 Brix、40 Brix、50 Brix、60 Brix的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。在溫度為28 ℃、起始pH為4.5的條件下發(fā)酵24 h后，分別測定各菌種發(fā)酵醪液在560 nm時(shí)的吸光度值。結(jié)果見圖5。

圖5 初始糖濃度對(duì)酵母菌生長的影響Fig.5 Yeasts’ tolerance to different sugar concentrations

從圖5 可以看出，當(dāng)初始糖度為20 Brix時(shí)，經(jīng)過一段時(shí)間的發(fā)酵培養(yǎng)，5種酵母菌株發(fā)酵液的吸光度均達(dá)到最大值。隨著糖度的增大和減小，各菌株的吸光度均減小。說明以橡實(shí)為淀粉質(zhì)發(fā)酵，初始糖度濃度在20 Brix左右較適合這5種酵母菌株的生長。當(dāng)糖度升高到60 Brix 時(shí)，酵母生長趨于停頓。5種酵母菌株發(fā)酵比較表明，XS03和XS04發(fā)酵速度明顯快于XS01、XS02和XS05等3種菌株。XS03和XS04的生長曲線一直位于其它3種菌株生長曲線的上方，說明該菌株對(duì)高糖的耐受能力更強(qiáng)。

初始發(fā)酵糖濃度對(duì)酵母菌生長存在一定的影響，如果糖濃度過低會(huì)使酵母菌因營養(yǎng)不足而導(dǎo)致生長緩慢；如果糖濃度過高又會(huì)因滲透壓增大而抑制酵母菌的生長繁殖。因此，選擇20 Brix左右的糖度對(duì)以橡實(shí)為原料的酵母菌是較合適的。

2.4 各酵母菌株的淀粉出酒率比較

酵母菌株在發(fā)酵過程中，利用淀粉質(zhì)原料不斷產(chǎn)生酒精，釋放出CO2，其重量隨之減少。不同酵母菌株的代謝能力有差異，對(duì)淀粉質(zhì)原料的利用程度不同，導(dǎo)致最終淀粉的出酒率也存在差別。各酵母菌株的各時(shí)段的CO2失重率及出酒率見表2。

表2 發(fā)酵醪液的CO2失重率及出酒率比較Table 2 Comparison of weight loss rate of CO2 and conversion rate of alcohol among fermented mashes

由表2可知，發(fā)酵24 h后各菌株間的失重率沒有顯著性差異（P＞0.05），但發(fā)酵36 h后各種酵母繼續(xù)產(chǎn)生CO2，重量不斷減輕，各酵母間的失重率存在顯著性差異（P＜0.05），XS03和XS04的失重率顯著高于XS01、XS02和XS05等3種菌種。此后各菌株仍在不斷發(fā)酵產(chǎn)生CO2，在48 h和60 h時(shí)測定的各菌株間發(fā)酵狀況和36 h的發(fā)酵狀況是一樣的，但48 h和60 h間的失重率變化較少，說明發(fā)酵到48 h時(shí)基本結(jié)束。對(duì)以栓皮櫟淀粉為原料的生產(chǎn)燃料酒精，5種菌株在淀粉出酒率方面有顯著性差異，XS03和XS04兩菌株的出酒率比XS01、XS02和XS05等3菌株要高。

3 小 結(jié)

橡實(shí)是一種資源豐富，淀粉含量高，但尚未得到有效開發(fā)利用的資源，以橡實(shí)淀粉為原料開發(fā)燃料酒精具有現(xiàn)實(shí)可行性。研究表明，從栓皮櫟自然發(fā)酵基質(zhì)中分離得到的5株優(yōu)良酵母菌性能測試顯示，篩選的5株酵母菌菌落形態(tài)基本一致，但酵母菌XS03和XS04的死亡率顯著低于XS01、XS02和XS05等3株酵母菌（P＜0.05）。在酒精濃度低于6%時(shí)發(fā)酵，XS03和XS04比XS01、XS02和XS05等具有更強(qiáng)的生命活力和耐高塘能力，發(fā)酵36 h后酵母XS03和XS04的失重率和出酒率顯著高于XS01、XS02和XS05等3種酵母菌（P＜0.05）。因此，酵母XS03和XS04是較適合栓皮櫟淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精的菌株。

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Screening of special yeast for ethanol production by acorn starch fermentation

LI An-ping1,2, XIE Bi-xia1, SHEN Wei1, JIANG Ya-qian1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.National Engineering Lab. for Rice and Byproducts Processing, Changsha 410004, Hunan, China)

36 yeast strains has been isolated from cork oak natural fermentation matrix, of them, five strains were selected by using the TTC plate change color chart, their’s fermentation performance were tested and compared each other. The results show that the colony morphology of the five yeast colonies were basically identical, but the yeast XS03 and XS04 mortality rate were significantly lower than the XS01, XS02 and XS05 other three yeast strains (P ＜0.05) mortality; under the condition of alcohol concentrations less than 6%, yeast XS03 and XS04 had higher alcohol tolerance and higher Gaotang resistance capacity than XS01, XS02 and XS05, etc. the weight loss rate and the yield of liquor of yeast XS03 and XS04 after being fermenting 36 hours, were significantly higher than that of XS01, XS02 and XS05 (P ＜0.05).

acorn starch; fermentation; yeast strain; screening

S789

A

1673-923X(2012)08-0098-05

2011-11-07

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“野生木本淀粉種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與精加工技術(shù)研究”（200804033）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目“橡實(shí)淀粉生物乙醇關(guān)鍵技術(shù)研究”（2010NK3040）

李安平（1967—），男，湖南永州人，教授，博士，主要從事林副產(chǎn)品深加工研究；E-mail：lianpinglianping@yahoo.com.cn

[本文編校：文鳳鳴]