劉玉倩，王海濤，李海洲，王 羽，宋文靖

低氧預防運動性低血色素中TMPRSS6對機體鐵代謝的調(diào)節(jié)

劉玉倩1，王海濤1，李海洲2，王 羽1，宋文靖1

目的：闡明跨膜絲氨酸蛋白酶6（TMPRSS6）在低氧預防運動性低血色素中對機體鐵狀態(tài)的調(diào)節(jié)機制，為預防運動性低血色素發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。方法：24只雄性Wistar大鼠隨機分為安靜對照組（CG）、運動性低血色素組（EG）和運動后低氧恢復組（HE），分別用ELISA檢測了血清鐵代謝指標，RT－PCR檢測肝鐵代謝相關(guān)基因表達。結(jié)果：1）HE組Hb、SF、骨髓鐵顯著高于EG（Hb：HE：139.56±10.24g／L，EG：113.16±17.36g／L，P＜0.01；SF：HE：29.72±2.85ng／mL，EG：18.23±3.57ng／mL，P＜0.01；骨髓鐵：HE：75.98± 7.08μg／g，EG：62.19±8.98μg／g，P＜0.05）。2）HE組肝HIF－1和TMPRSS6mRNA顯著高于EG（P＜0.05）。3）HE組m－HJV和hepcidin mRNA和肝鐵顯著低于EG（肝鐵含量：HE：80.18±13.66μg／g，EG：111.51±12.64μg／g，P＜0.01）。結(jié)論：從組織層面和分子生物學層面上進一步支持和完善了低氧對鐵代謝的調(diào)控模型：通過HIF－1刺激TMPRSS6高表達，降低hepcidin，從而促進肝釋鐵蛋白FPN1表達，貯存鐵釋放，滿足運動中機體合成Hb對鐵的需求，這可能是防止運動性低血色素發(fā)生的原因之一。

跨膜絲氨酸蛋白酶6；低氧；運動性低血色素；鼠；動物實驗

跨膜絲氨酸蛋白酶6（transmembrance serine proteases 6，TMPRSS6，也稱為matriptase－2）是2008年Du等發(fā)表在《Science》上的論文首先報導的肝抗菌多肽（Hepcidin）的第一個負調(diào)節(jié)子，而高表達的hepcidin會抑制腸鐵吸收，引發(fā)運動性低血色素。因此，TMPRSS6的正常表達對維持機體鐵的動態(tài)平衡和紅細胞生成起到重要作用［12，19］。國內(nèi)、外一些研究表明，運動員依然普遍存在運動性鐵缺乏［13，14］，而鐵參與氧的轉(zhuǎn)運、貯存與利用及ATP合成等許多生理過程，鐵對呼吸和能量代謝都具有重要的影響［3］。此外，適度低氧條件下EPO顯著升高，促進紅細胞生成，提高運氧能力。在大強度運動過程中機體通過適宜低氧刺激，對預防運動性低血色素的調(diào)節(jié)作用還需深入研究。因此，本文研究了TMPRSS6在低氧防治運動性低血色素中對組織鐵分布、肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用。

1 研究方法

1.1 動物分組和運動方案

雄性Wistar大鼠24只，體重250±10g，購自河北醫(yī)科大學動物養(yǎng)殖中心，選用國家標準嚙齒類動物干飼料喂養(yǎng)（鐵含量為100mg／kg），自由飲水。環(huán)境溫度22℃～24℃，相對濕度為45%～55%。將大鼠隨機分為安靜對照組（control group，CG）、運動性低血色素組（exercise－associated anemia group，EG）和運動后低氧恢復組（hypoxia after exercise group，HE），每組各8只。低氧運動組每天在低氧艙8h。采用常壓低氧艙在13.6%的氧濃度（相當于海拔3 500m）［5］。運動性低血色素模型參考趙杰修等的運動方案［6］：跑臺坡度為0，30m／min，6d／week，前2周1次／天，后2周2次／天。第1次訓練時間為1min，每次遞增2min。訓練4周，最后1次訓練時間為71min。運動后4周末取材。

1.2指標檢測方法

用血細胞自動分析儀（MEK－6318K）測定血常規(guī)。取血清－80℃保存；大鼠用DEPC生理鹽水灌流后取肝50～100mg，迅速投入液氮中以備做RT－PCR。原子吸收分光光度計（AA240FS，VARIAN）測定肝和骨髓總鐵含量。Western Blot檢測肝臟膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（ferroportin 1，F(xiàn)PN1）（ADI）的表達，統(tǒng)計目的蛋白與β－actin的MaxOD比值。RTPCR法測定大鼠肝鐵代謝相關(guān)基因mRNA，PCR引物堿基序列參考DIDIER等［10］和Zhang等［22］的報道［4，17］，上海生工合成，內(nèi)參為β－actin［1］。血清EPO、鐵蛋白（Serum Ferritin，SF）測試，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗（ABC－ELISA），EPO、SF試劑盒（Abcam，USA），嚴格按試劑盒說明書操作。1.3 結(jié)果統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)一律采用SPSS 18.0進行單因素方差分析（UNIANOVA），多重比較采用SNK法。實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差±SD）表示，顯著性水平為P＜0.05，非常顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血常規(guī)和血清鐵狀態(tài)比較

表1顯示，EG組Hb、RBC和Hct顯著低于CG和HE組，說明4周遞增負荷跑臺運動誘發(fā)大鼠產(chǎn)生了運動性低血色素（P＜0.01），而低氧則促進Hb的恢復。EG和HE組的EPO顯著高于CG組（P＜0.01）。EG組血清SF含量低于CG和HE組（P＜0.01）。

2.2 運動和低氧對鐵在大鼠各器官鐵分布的影響

表2顯示，EG組骨髓鐵含量顯著下降（P＜0.01），肝鐵含量高于HE（P＜0.01）。HE組骨髓鐵含量高于EG組（P＜0.05），肝鐵含量顯著低于EG和CG組（P＜0.01）。

表1 本研究運動后各組大鼠血常規(guī)和血清鐵狀態(tài)比較一覽表Table 1 Effects of Treadmill Running on Blood Parameters，Serum Iron Status in Rats （，n＝8）

表1 本研究運動后各組大鼠血常規(guī)和血清鐵狀態(tài)比較一覽表Table 1 Effects of Treadmill Running on Blood Parameters，Serum Iron Status in Rats （，n＝8）

注：與CG相比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與EG相比：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；下同。

安靜對照組（Control group，CG）運動性低血色素組（Exercise－associated anemia group，EG）運動后低氧恢復組（Hypoxia after exercise group，HE）Hb（g／L） 147.11±5.51 113.16±17.36＊＊ 139.56±10.24＃＃紅細胞計數(shù)（1012／L）（Red blood cell count，RBC） 7.38±0.38 5.73±1.22＊＊7.02±1.17＃紅細胞壓積（%）（Hematokrit，Hct） 41.05±0.95 34.17±2.68＊＊ 39.85±1.13＃促紅細胞生成素（mIU／mL）（Erythropoietin，EPO） 17.79±2.35 31.88±5.29＊＊ 28.53±3.28＊＊血清鐵蛋白（ng／mL）（Serum，ferritin，SF） 32.27±1.43 18.23±3.57＊＊ 29.72±2.85＃＃

2.3 低氧恢復對大鼠肝鐵代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響

圖1顯示，HE組肝臟的HIF－1和TMPRSS6mRNA顯著高于CG和EG組（P＜0.01，P＜0.05）；肝鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（hemo juvelin，m－HJV）和hepcidin的mRNA低于CG和EG組（P＜0.01，P＜0.05）。EG組TMPRSS6mRNA低于CG組（P＜0.05）。

2.4 低氧恢復對大鼠肝FPN1蛋白表達的影響

HE組肝FPN1表達顯著高于CG和EG組（P＜0.01），CG與EG兩組肝的FPN1表達無明顯差別。

研究結(jié)果表明，長時間、大強度運動引起機體Hb下

3 討論

3.1 運動后低氧恢復對機體鐵狀態(tài)的影響

降，而運動后的低氧恢復很好地緩解了Hb下降的趨勢。增高的Hb有利于運動中氧的轉(zhuǎn)運和利用。低氧引起Hb增多主要是由于低氧刺激促進腎臟合成EPO增多，從而提高了機體紅細胞和血紅蛋白的水平［7］。長時間、大強度運動引發(fā)的運動性低血色素組和運動后低氧恢復組的EPO值均高于對照組，但運動性低血色素組的Hb水平較低，這說明除了EPO，還有其他因素影響Hb含量。Hb含有4個血紅素鐵，因此，機體鐵狀態(tài)是影響Hb合成的重要因素。運動性低血色素組的血清鐵蛋白（SF）水平較低。而SF與機體貯鐵量高度相關(guān)，1μg／L的血清鐵蛋白相當于8～10mg的貯存鐵，因此，臨床上經(jīng)常把血清鐵蛋白作為反映機體鐵狀態(tài)的敏感指標［2］。實驗結(jié)果表明，運動性低血色素組的鐵貯量低于低氧恢復和對照組，雖然運動性低血色素組EPO含量較高，但由于無法獲得充足的鐵，仍會影響運動中Hb和肌紅蛋白（myoglobin，Mb）及參與能量代謝的細胞色素酶的合成，從而影響機體對氧的轉(zhuǎn)運和利用。

表2 本研究各組大鼠不同器官鐵分布的比較一覽表Table 2 Effects of Treadmill Running on Iron Storage in Rats （，n＝8）

表2 本研究各組大鼠不同器官鐵分布的比較一覽表Table 2 Effects of Treadmill Running on Iron Storage in Rats （，n＝8）

安靜對照組（Control group，CG）運動性低血色素組（Exercise－associated anemia group，EG）運動后低氧恢復組（Hypoxia after exercise group，HE）骨髓總鐵含量（μg／g）（Iron storage in bone marrow） 81.83±5.79 62.19±8.98＊＊ 75.98±7.08＃肝臟總鐵含量（μg／g）（Iron storage in liver） 107.44±7.41 111.51±12.64 80.18±13.66＊＊＃＃

3.2 低氧對機體貯存鐵重新分布的影響

在運動過程中，機體內(nèi)的鐵會發(fā)生重新分布，鐵從一些貯鐵器官運送至利用鐵的器官。肝臟是重要的貯鐵器官，F(xiàn)PN1是位于細胞膜上的鐵釋放蛋白，廣泛存在于十二指腸吸收細胞基底側(cè)、肝細胞和巨噬細胞中，主要作用是將細胞內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng)［11］。低氧恢復組肝細胞FPN1的表達顯著高于對照組和運動性低血色素組，增加的FPN1促進肝細胞內(nèi)貯存鐵的釋放，滿足運動中機體對鐵的需求，減少機體對骨髓鐵的動用。這就可以解釋結(jié)果中運動后低氧恢復組的肝臟鐵含量降低，骨髓鐵與對照組相比卻無明顯變化，但高于運動性低血色素組。而運動性低血色素組的肝臟貯存鐵無明顯變化，骨髓鐵含量明顯減少，這可能是機體鐵代謝紊亂所致，具體機制尚需進一步探討。

FPN1的表達主要受肝分泌的抗菌多肽hepcidin的負調(diào)控［9］。高表達的hepcidin可與FPN1結(jié)合，促進FPN1內(nèi)化，失去轉(zhuǎn)運鐵的功能。而運動后低氧恢復組肝hepcidin的mRNA顯著低于對照組和運動性低血色素組，減少了對肝細胞FPN1的抑制，促進肝貯存鐵的釋放。

3.3 低氧環(huán)境中TMPRSS6對hepcidin的調(diào)節(jié)機制

TMPRSS6主要是通過負調(diào)控肝抗菌多肽（hepcidin）而調(diào)節(jié)機體鐵的動態(tài)平衡［12］。2011年有研究報道，低氧誘導因子（hypoxia－inducible factor，HIF）可能是TMPRSS6的上游調(diào)節(jié)因子［16］。HIF包括HIF－1和HIF－2。相對HIF－2，HIF－1的研究較為深入。二者在低氧條件下對機體的調(diào)控作用有所區(qū)別。HIF－1作為機體低氧應答的關(guān)鍵因子，可誘導多種與鐵代謝相關(guān)蛋白的表達而影響機體的造血、鐵代謝等功能［21］。這種依賴HIF的調(diào)控通路會增加TMPRSS6表達，促進細胞膜上HJV脫落，降低肝細胞hepcidin的表達［15，20］。而在低氧環(huán)境中可通過降低肝細胞瘤中SMAD信號而抑制hepcidin表達［8］。HIF－2則可能主要參與了腸鐵吸收的調(diào)控［18］。低氧恢復組肝臟 HIF－1和 TMPRSS6的表達顯著高于對照組和運動性低血色素組，而m－HJV的表達顯著低于其他兩組，也進一步說明低氧促進HIF－1和TMPRSS6表達，降低m－HJV表達，抑制肝hepcidin表達，促進肝細胞貯存鐵的釋放，進而維持運動中機體對鐵的需求，而不至引發(fā)運動性低血色素。此外，由于hepcidin是腸鐵吸收的負調(diào)節(jié)子，HIF－2主要作用于小腸［18］，因此，低氧環(huán)境下腸鐵吸收的變化需做進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從組織層面和分子生物學層面上進一步支持和完善了低氧對鐵代謝的調(diào)控模型，通過HIF－1刺激TMPRSS6高表達，降低肝臟合成hepcidin，增加肝貯存鐵的釋放，促進鐵在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運，而滿足運動中機體對鐵的需求。因此，適度低氧會促進鐵在體內(nèi)的重新分布，使鐵由貯存部位向循環(huán)系統(tǒng)釋放，改善機體的鐵狀態(tài)，這可能是低氧預防運動性低血色素發(fā)生的原因之一。除了HIF－1，還有HIF－2可能在低氧環(huán)境中對機體鐵代謝也起到重要調(diào)控作用，其機制尚需深入研究。

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Effects of TMPRSS6on the Iron Metabolism of Rats in the Prevention of Exercise－Associated Anemia by Hypoxia

LIU Yu－qian1，WANG Hai－tao1，LI Hai－zhou2，WANG Yu1，SONG Wen－jing1

Objective：To illuminate effects of hypoxia on iron metabolism in the prevention of exercise－associated anemia.Methods：24male Wistar rats were randomly divided into three groups，the control group（CG），and the strenuously exercised group（EG），and the hypoxia exercise group（13.6%O2，8h／d，HE）.The content of erythropoietin（EPO）and serum Ferritin（SF）were examined by ELISA kits（Abcam）.The mRNAs of hepatic hepcidin，hypoxiainducible factor 1（HIF－1），transmembrane serine proteases 6（TMPRSS6）and hemojuvelin（m－HJV）were examined by RT－PCR.Results：1）Compared with EG，the Hb，SF，and iron storage in bone marrow of HE were significantly increased（Hb：HE：139.56±10.24g／L，EG：113.16±17.36g／L，P＜0.01；SF：HE：29.72±2.85ng／mL，EG：18.23±3.57ng／mL，P＜0.01；iron storage in bone marrow：HE：75.98±7.08μg／g，EG：62.19±8.98μg／g，P＜0.05）.2）Compared with EG，the mRNAs of HIF－1and TMPRSS6in the liver of HE were significantly increased.3）The mRNAs of HJV and Hepcidin of HE were decreased compared to EG，and the iron storage in liver was decreased in HE（HE：80.18±13.66μg／g，EG：111.51±12.64μg／g，P＜0.01）.Conclusions：Moderate hypoxia plays an important role in preventing exercise－induced iron deficiency.Exposure to hypoxia，the increased HIF－1 in liver stimulates the expression of TMPRSS6，and as a result，the synthesis of Hepcidin is decreased，which leads to the iron mobilization in liver to meet the requirement of iron during strenuous exercise，which prevents the exercise－associated anemia.

TMPRSS6；hypoxia，exercise－associated anemia；rat；animal experiment

G804.7

A

1000－677X（2012）10－0069－04

2012－07－29；

2012－09－17

國家自然科學基金資助項目（30700390）；河北省自然科學基金資助項目（C2009000291）；河北師范大學基金項目（L2011Y10）。

劉玉倩（1973－），女，河北保定人，教授，博士，碩士研究生導師，研究方向為運動與鐵代謝的分子生物學機制，E－mail：yuqianht＠126.com；王海濤（1973－），男，河北廊坊人，副教授，博士，碩士研究生導師，研究方向為運動與鐵代謝的分子生物學機制，E－mail：haitaoyq＠126.com。

1.河北師范大學體育學院，河北石家莊050024；2.河北廊坊師范學院，河北廊坊065000

1.Department of Physical Education，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China；2.Langfang Teachers′College，Langfang 065000，China.