薛銀剛，蔡煥興，徐東炯，袁 靜，施華宏，唐松林

(1.常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213001;2.華東師范大學(xué)，上海 200062;3.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210036)

·監(jiān)測(cè)技術(shù)·

熱帶爪蟾胚胎在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

薛銀剛1，蔡煥興1，徐東炯1，袁 靜2，施華宏2，唐松林3

(1.常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213001;2.華東師范大學(xué)，上海 200062;3.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210036)

分析了熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的理論基礎(chǔ)，綜述了其在環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用前景，總結(jié)評(píng)價(jià)了熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的方法及應(yīng)用實(shí)例，并討論了其用于水質(zhì)評(píng)價(jià)目前存在的問(wèn)題。熱帶爪蟾是一種良好的模式生物，需要對(duì)其加強(qiáng)實(shí)際應(yīng)用研究。

熱帶爪蟾;胚胎;致畸;水質(zhì)監(jiān)測(cè)

0 引言

近年來(lái)，由于人類(lèi)活動(dòng)的影響，大量的各類(lèi)污染物排放到水體中。這些排放到水環(huán)境中的污染物可能會(huì)在生物體內(nèi)富集、放大，從而導(dǎo)致對(duì)食物鏈高營(yíng)養(yǎng)級(jí)野生動(dòng)物的嚴(yán)重危害［1］;也可以通過(guò)暴露(大氣、水等)與食品的途徑進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)水體環(huán)境、水生動(dòng)物和人體健康造成極大威脅［2］。這些環(huán)境問(wèn)題引起了研究者對(duì)水質(zhì)監(jiān)測(cè)的高度重視。然而，中國(guó)水質(zhì)監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法主要偏向于常規(guī)的理化檢測(cè)，這已經(jīng)不足以說(shuō)明和反映水環(huán)境的毒性效應(yīng)。隨著生態(tài)學(xué)、生物學(xué)及生物技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，水質(zhì)的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)也日益得到重視。生物監(jiān)測(cè)通過(guò)生物對(duì)環(huán)境的反應(yīng)，顯示出環(huán)境污染對(duì)生物的影響，將污染物的濃度及其引起的生物效應(yīng)聯(lián)系起來(lái)，能夠更真實(shí)、準(zhǔn)確地反映污染物的作用機(jī)理及實(shí)際毒性效應(yīng)，為環(huán)境監(jiān)測(cè)和管理提供更為有效的信息。

1 爪蟾胚胎致畸實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介

自20世紀(jì)90年代初，國(guó)外就開(kāi)始運(yùn)用非洲爪蟾胚胎開(kāi)展污染物的發(fā)育毒性檢測(cè)，其方法就是將發(fā)育期處于NF 8- 11階段的爪蟾胚胎置于受試液中暴露4 d，通過(guò)檢測(cè)胚胎死亡率、畸形率和致畸指數(shù)等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)品的發(fā)育毒性，這一方法被稱為非洲爪蟾胚胎致畸實(shí)驗(yàn)(FETAX)［3］。非洲爪蟾(Xenopus laevis)是進(jìn)行FETAX的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，作為發(fā)育生物學(xué)中最重要的模式動(dòng)物，近年來(lái)在生態(tài)毒理學(xué)中也被廣泛運(yùn)用，主要用于早期胚胎發(fā)育和細(xì)胞生物學(xué)的研究。

近十年來(lái)各國(guó)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究證實(shí)，F(xiàn)ETAX作為一個(gè)可供選擇的發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)非常具有前途，它比使用傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物作為發(fā)育毒性研究的受試生物更能節(jié)約動(dòng)物數(shù)量、時(shí)間和資金［4］。

2 熱帶爪蟾胚胎在環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用前景

作為非洲爪蟾的近親，熱帶爪蟾(X.tropicalis)具有個(gè)體更小、生長(zhǎng)周期更短(3～6個(gè)月)、產(chǎn)卵量更大(2 000～3 000個(gè))和基因組結(jié)構(gòu)(2倍體)更簡(jiǎn)單、胚胎發(fā)育更快等優(yōu)點(diǎn)。因此，熱帶爪蟾比非洲爪蟾更適合作為模式生物進(jìn)行系列研究［5-7］。已有研究表明，不同的污染物導(dǎo)致熱帶爪蟾胚胎畸形現(xiàn)象也不一樣，而且某些污染物能夠?qū)е伦概咛ギa(chǎn)生獨(dú)特的畸形表型，如采用環(huán)境濃度三丁基錫(50～400 ng·L-1TBTCl)對(duì)熱帶爪蟾胚胎進(jìn)行24，36和48 h暴露能夠?qū)е屡咛パ劬Ξ惓?、泄殖腔突出和鰭變窄等多種畸形現(xiàn)象［8］。這表明運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎進(jìn)行特定污染物致畸機(jī)制的研究將具有較大的潛力。其中，胚胎畸形的表觀特征可以作為研究污染物致畸機(jī)制的標(biāo)志物。

3 熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的方法

3.1 樣品的采集與制備

對(duì)各采樣點(diǎn)進(jìn)行樣品的采集，采集后用棕色瓶分裝并貼好標(biāo)簽，4℃保存待用。在采樣過(guò)程中對(duì)采樣點(diǎn)的常規(guī)理化數(shù)據(jù)(溫度、pH、溶解氧、氨、采樣點(diǎn)經(jīng)緯度、電導(dǎo)率等)進(jìn)行測(cè)量。

3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)在FETAX實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。采用人工注射HCG的方法誘導(dǎo)產(chǎn)卵，從產(chǎn)卵較好的3對(duì)蛙的胚胎中，挑選出達(dá)到NF 10- 11階段且發(fā)育正常的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表1)。

表1 熱帶爪蟾胚胎的水質(zhì)監(jiān)測(cè)方法

續(xù)表1

3.3 樣品的觀測(cè)與分析

將存活胚胎用100 mg/L MS- 222麻醉處理后固定于4%的甲醛溶液中，取出經(jīng)固定的胚胎，在Nikon解剖鏡下觀察胚胎的發(fā)育狀況，用 Nikon DS-SM型顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并統(tǒng)計(jì)孵化率、存活率、體長(zhǎng)和畸形率等指標(biāo)。(1)孵化率:24 h后孵化胚胎個(gè)數(shù)所占最初放入胚胎個(gè)數(shù)百分比;(2)存活率:48 h后存活胚胎個(gè)數(shù)所占孵化出的個(gè)數(shù)百分比;(3)體長(zhǎng):胚胎頭部至尾尖的水平距離;(4)畸形率:48 h后胚胎畸形個(gè)數(shù)所占存活個(gè)數(shù)百分比。通過(guò)對(duì)這些指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)綜合評(píng)價(jià)環(huán)境樣品對(duì)胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育的影響，從而反映水質(zhì)的情況。

同時(shí)，通過(guò)對(duì)胚胎的暴露實(shí)驗(yàn)觀測(cè)爪蟾胚胎的表觀畸形類(lèi)型及表型特征變化，探討可能的致畸機(jī)制，從而推測(cè)可能的污染物類(lèi)型。暴露48 h后與對(duì)照組相比，環(huán)境樣品能夠誘導(dǎo)熱帶爪蟾胚胎出現(xiàn)多種畸形現(xiàn)象，總體可以分為體形和體色兩大類(lèi)。在體形變化中，根據(jù)出現(xiàn)畸形的部位可以分為5種類(lèi)別，即顱面、眼睛、嘴巴、腸道、尾巴和體色。每個(gè)部位又有多種不同特征的畸形類(lèi)型，其中主要表現(xiàn)為眼睛突出、泄殖腔膨大、尾巴下彎、鰭變窄和皮膚色素減少等(圖1)。

3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。以每孔中的胚胎為一個(gè)平行樣，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)表示，n=4。用Tukey-test進(jìn)行分析。

圖1 環(huán)境樣品引起的熱帶爪蟾胚胎畸形類(lèi)型

4 熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的應(yīng)用實(shí)例

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外主要運(yùn)用斑馬魚(yú)和非洲爪蟾進(jìn)行水體中重金屬毒性、有機(jī)污染物毒性檢測(cè)和綜合毒性檢測(cè)等。Hoke等研究表明，F(xiàn)ETAX已經(jīng)成為水環(huán)境監(jiān)測(cè)的常規(guī)方法，可以增加其他淡水水生生物的檢測(cè)性。

Song和Fort等運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎和非洲爪蟾胚胎的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)物種對(duì)化合物的致畸能力相當(dāng)，而且畸形的綜合表征也類(lèi)似，熱帶爪蟾可以代替非洲爪蟾進(jìn)行FETAX實(shí)驗(yàn)［9，10］。已有的研究表明，熱帶爪蟾胚胎可以不同程度地應(yīng)用于重金屬、農(nóng)藥、藥物等有機(jī)污染物和綜合污染物的毒性檢測(cè)中，且主要用于污染物的室內(nèi)研究［11-13］。

目前，國(guó)內(nèi)外用于評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法主要包括對(duì)水樣和底泥兩類(lèi)環(huán)境樣品的各類(lèi)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎檢測(cè)了溫州黑臭河道的水樣和底泥樣的生態(tài)毒性。結(jié)果表明:不同采樣點(diǎn)的孵化率、存活率、體長(zhǎng)和畸形率較對(duì)照組表現(xiàn)出了不同的差異性，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果說(shuō)明溫州市兩條典型的黑臭河道底泥對(duì)爪蟾胚胎的發(fā)育均有不同程度的影響，表現(xiàn)出一定的生態(tài)毒性，同時(shí)，運(yùn)用爪蟾胚胎可以有效地檢測(cè)底泥的毒性效應(yīng)，而且對(duì)不同河流和站點(diǎn)的毒性評(píng)價(jià)具有較好的區(qū)分度。實(shí)驗(yàn)室對(duì)長(zhǎng)江口南匯杭州灣的底泥也進(jìn)行了毒性測(cè)試，結(jié)果表明，人為活動(dòng)影響越大的區(qū)域，底泥樣對(duì)胚胎的發(fā)育毒性影響越嚴(yán)重，展現(xiàn)出了很好的區(qū)分度。

5 問(wèn)題與展望

將熱帶爪蟾胚胎應(yīng)用于水質(zhì)的生物監(jiān)測(cè)還處于起步階段，盡管其所需要的時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)成本低，暴露48 h就能夠方便地獲得各種評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，但在環(huán)境樣品的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，需要將不同采樣點(diǎn)的水質(zhì)狀況更好地區(qū)分出來(lái)僅參照現(xiàn)有的指標(biāo)尚有一定的局限性，因此，必須對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)一步優(yōu)化，如適當(dāng)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間和對(duì)畸形指標(biāo)細(xì)化、量化。其中，在指標(biāo)的量化中，可以考慮將各個(gè)類(lèi)型的畸形程度劃分為正常、輕微、中等和嚴(yán)重4個(gè)等級(jí)。

綜上所述，熱帶爪蟾作為一種評(píng)價(jià)水質(zhì)的生物已得到越來(lái)越多的認(rèn)可。雖然目前在理論和應(yīng)用方面還存在一定的問(wèn)題，但隨著熱帶爪蟾模式生物在各領(lǐng)域研究的發(fā)展，其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用會(huì)更加深入廣泛。

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Application ofXenopus TropicalisEmbryo in Water Quality Monitoring

XUE Yin-gang1，CAI Huan-xing1，XU Dong-jiong1，YUAN Jing2，SHI Hua-hong2，TANG Song-lin3
(1.Key Laboratory of Environmental Protection of Water Environment Biological Monitoring of Jiangsu Province，Changzhou Environmental Monitoring Center，Changzhou，Jiangsu 213001，China;2.East China Normal University，Shanghai，200062，China;3.Jiangsu Province Environmental Monitoring center，Nanjing，Jiangsu 210036，China)

The theoretic foundation ofXenopus tropicalisapplied to water quality monitoring was discussed.Subsequently，the application prospect ofX.tropicalis in the field of environmental science was reviewed.We also summarized the method usingXenopus tropicalisembryo to monitor water quality and introduced some application examples.Finally，discussed some problems on the application ofX.tropicalisembryo in evaluating water quality.In all，X.tropicalisis a good model animal species for evaluating water quality.Therefore，studies on practical application ofX.tropicalisshould be enhanced in future.

Xenopus tropicalis;embryos;water quality monitoring

X835

A

1674- 6732(2012)04- 0020- 04

10.3969/j.issn.1674- 6732.2012.04.005

2011- 12- 20

江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)科研基金項(xiàng)目(1106)。

薛銀剛(1981—)，男，工程師，博士，從事生物監(jiān)測(cè)與環(huán)境毒理學(xué)工作。