劉超，袁鐘平，吳稚偉

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共健康醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇南京 210093)

F18［1］是calanolide A(吡喃型香豆素類化合物)的含氯衍生物，作為一種新型的艾滋病毒非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)，正處于相關(guān)臨床研究中;尼非韋羅［2］為合成的小分子 CCR5(人CC趨化因子受體5)拮抗劑，具有良好的抑制HIV-1感染的效果，其已經(jīng)作為殺微生物劑［3］在中國完成了臨床前研究，申請進行人體臨床試驗，二者的結(jié)構(gòu)式見圖1。通過兩個或者兩個以上藥物混合起來的殺微生物劑被認(rèn)為將有效提高阻斷HIV-1性傳播的效率，從而降低傳播率［4］。尼非韋羅是有效的CCR5侵入抑制劑，而F18能高效抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄，二者有望在抗感染上形成良好的互補，配伍為復(fù)合殺微生物劑，但是二者都具有水溶性差的特點(溶解度都小于100 μg·ml-1)。本研究觀察增溶劑Solutol HS15［7］同時溶解F18和尼非韋羅的效率，同時探索液相色譜條件［5-6］使之能夠有效地區(qū)分這兩種化合物，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 F18和尼非韋羅的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Molecular structure of F18 and nifeviroc

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀;島津LCsolution色譜工作站GL Science Inertsil ODS column(4.60 mm ×250 mm，5 μm);BT124S 電子天平(德國賽多利斯);pHSJ-4A型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。尼非韋羅對照品(上海靶點藥物有限公司，批次200910，純度＞98%)，F(xiàn)18(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，20091009，純度 ＞98%)，Solutol HS15(巴斯夫中國有限公司提供)，甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.60 mm×250 mm，5 μm)，采用甲醇(A 相)-復(fù)方醋酸緩沖液(B相，pH 4.5)為洗脫系統(tǒng)流動相。復(fù)方醋酸緩沖液配制方法:稱取醋酸銨2.3 g，加水500 ml溶解并用醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，然后稱取樟腦磺酸2.3 g，加水至1 000 ml。A 相和 B 相比例為65 ∶35，流速為1 ml·min-1，檢測波長為265 nm，柱溫為30℃，進樣量為20 μl。相鄰兩峰的分離度不小于1.5。

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取F18 10 mg、尼非韋羅10 mg，將混合物加入10 ml容量瓶中，用甲醇定容制成1 mg·ml-1的溶液，作對照品線性貯備液。稀釋對照品貯備液，得20、60、100、140、180 μg·ml-1系列濃度對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

精密稱取F18 10 mg、尼非韋羅10 mg，同時置于2 ml Solutol HS15中至完全溶解，將混合物加入10 ml容量瓶中，用甲醇定容制成1 mg·ml-1的溶液，作供試品線性貯備液。稀釋供試品貯備液，得20、60、100、140、180 μg·ml-1系列濃度供試品溶液。

1.5 陰性對照液的制備

取2 ml Solutol HS15，用甲醇定容至10 ml容量瓶中。

1.6 檢測波長的選定

采用紫外分光光度計測定兩種藥物的吸光度，從250～280 nm進行測定，1 nm為間隔，出現(xiàn)了一個拋物線狀的吸收峰，取二者峰值最大處265 nm為HPLC檢測條件。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性試驗

分別精密吸取進樣溶液各20 μl注入液相色譜儀，在選定的色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖2。由圖2可見，F(xiàn)18和尼非韋羅在Solutol HS 15(HS15)中的測定無干擾，且能完全區(qū)分兩種物質(zhì)。

圖2 化合物的高效液相色譜結(jié)果Fig 2 HPLC results of F18 and nifeviroc in Solutol HS15

2.2 線性范圍

稀釋對照品貯備液，得 20、60、100、140、180 μg·ml-1系列濃度對照品溶液，在選定的色譜條件下分別進樣20 μl，記錄各色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、進樣量為橫坐標(biāo)進行線性回歸，各化合物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1，兩種化合物的線性范圍均為20～180 μg·ml-1。

表1 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab 1 Regression equation and correlation coefficient

2.3 樣品檢出限試驗

取上述1 mg·ml-1的樣品溶液，分別稀釋 10、100、1 000 倍，樣品稀釋至 100、10、1 μg·ml-1，仍然非常穩(wěn)定，說明樣品的含量極少時仍然能夠被靈敏地檢測出。

2.4 精密度和穩(wěn)定性

取1 mg·ml-1供試品，連續(xù)進樣6次，其 RSD為0.943 808%(RSD＜5%)，表明本方法精密度良好。取上述供試品溶液，進行穩(wěn)定性考察，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h 進樣20 μl測定，其 RSD 為1.091 056%，結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。取同一混合對照品溶液3組，分別在24、48、72 h按前述色譜條件進樣測定，計算方法的精密度，結(jié)果為RSDF18=0.99%，RSD尼非韋羅=1.07%，表明本法的精密度良好。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱取F18和尼非韋羅各8、10、12 mg，每組3份，加入 10 ml容量瓶中，制備濃度為 0.8、1.0、1.2 mg·ml-1的溶液各3份，按上述色譜條件測定低、中、高3個加樣水平平均回收率，結(jié)果顯示F18 3個加樣水平的平均回收率分別為102.5%(RSD=1.32%)、101.6%(RSD=1.43%)和 98.8%(RSD=1.51%)，加樣平均回收率為100.5%(RSD=2.32%，n=9);尼非韋羅3個加樣水平分別為101.4%(RSD=1.17%)、100.2%(RSD=1.35%)和 99.8%(RSD=1.51%)，加樣平均回收率為100.4%(RSD=1.52%，n=9)。

3 討 論

Solutol HS 15是一種現(xiàn)代高效能、極低毒性的增溶劑，溶血作用低;生理耐受性較高;可用蒸汽滅菌法，無需昂貴的無菌制造工藝;由于其溶解兩種藥物都能達到10 mg·ml-1以上的溶解度，而且溶解后和中性磷酸緩沖液混合后呈澄清狀態(tài)，無明顯的藥物析出跡象，符合陰道內(nèi)環(huán)境使用，因此適合應(yīng)用在殺微生物劑研究領(lǐng)域。本研究將其作為F18和尼非韋羅的溶劑的結(jié)果顯示，Solutol HS 15能夠很好地溶解F18和尼非韋羅。本研究選用的是緩沖鹽洗脫體系，選用的增溶劑和流動相的高效液相檢測結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、線性關(guān)系良好，藥物在溶劑中能夠長時間地儲存而且沒有明顯的分解，液相條件二者的峰值區(qū)分度良好。本研究所建立的分析檢測條件具有較好的線性動態(tài)范圍，良好的重復(fù)性和靈敏度，能夠為后續(xù)的研究提供有效的檢測和分析手段，為以后的陰道殺微生物劑及聯(lián)合用藥奠定了基礎(chǔ)。本研究僅僅局限于色譜條件的摸索，缺乏相應(yīng)的病毒學(xué)數(shù)據(jù)，在以后的研究中將會利用本研究成果進一步進行細(xì)胞學(xué)和動物學(xué)的相關(guān)實驗。

［1］LU X，LIU L，ZHANG X，et al.F18，a novel small-molecule nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor，inhibits HIV-1 replication using distinct binding motifs as demonstrated by resistance selection and docking analysis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(1):341-351.

［2］XIE W D，CHENG Z.Determination of nifeviroc，a novel CCR5 antagonist:application to a pharmacokinetic study［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56(3):637-640.

［3］PADIAN N S，McCOY S I，ABDOOL-KARZW S S，et al.HIV prevention transformed:the new prevention research agenda［J］.Lancet，2011，378(9787):269-278.

［4］LIU S，LU H，NEURATH A R，et al.Combination of candidate microbicides cellulose acetate 1，2-benzenedicarboxylate and UC781 has synergistic and complementary effects against human immunodeficiency virus type 1 infection［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49(5):1830-1836.

［5］倪沖，繆玉山，陳國明.高效液相色譜法測定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有關(guān)物質(zhì)的含量［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，27(5):365-367.

［6］吳佳聰，彭丹紅，任慕蘭.陰道微生態(tài)的研究進展［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，29(6):702-706.