顧小軍，沈玲，黃英

(東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)科，江蘇南京 210003)

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患傳染病，病死率100%，全世界每年有6萬人死于該?。?］，近幾年每年約1 200～1 500萬人接受狂犬病病毒暴露后接種［2］。目前降低暴露后病人發(fā)病最關(guān)鍵和最有效的方法就是實施暴露后狂犬病疫苗免疫。在緊急暴露患者，特別是潛伏期較短的患者，如何使機體盡快產(chǎn)生抗狂犬病病毒的保護性中和抗體，或者在抗體產(chǎn)生前機體具有一定的抵抗力是直接關(guān)系到免疫成敗的關(guān)鍵［3］。有研究［4-5］顯示胸腺肽可加強狂犬病疫苗的接種效果，我們使用單劑量胸腺肽聯(lián)合狂犬病疫苗進行接種，對其增強狂犬病疫苗的療效進行了觀察和研究。

1 對象和方法

1.1 研究對象及分組

狂犬病暴露后的人群中Ⅱ級咬傷者100例，年齡18～59歲，身體健康，無不良嗜好。分成疫苗組50例，單獨給予狂犬病疫苗 2.5 U，按 0、3、7、14、28 接種;胸腺肽組50例，在疫苗組基礎(chǔ)上首針加用單劑量胸腺肽50 mg肌肉注射。

1.2 試劑

胸腺肽50 mg·支-1，長春普華制藥生產(chǎn);狂犬病疫苗2.5 U·支-1，賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

在注射前(D0)、注射后7 d(D7)、注射6個月、注射12個月測定外周血淋巴細胞總數(shù)、γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)水平，在注射后7 d、注射6個月、注射12個月測定中和抗體水平。外周血淋巴細胞總數(shù)采用全血細胞計數(shù)儀計數(shù)，由本院檢驗中心完成。IL-2和IFN-γ含量測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定，試劑購自上海森雄科技實業(yè)有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。IL-2最低檢測值為＞16 pg·ml-1，IFN-γ 最低檢測值為 ＞8 pg·ml-1。中和抗體測定采用快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)，按參考文獻［6］使用的方法檢測，具體操作由武漢生物制品研究所進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 實驗前后兩組外周血淋巴細胞總數(shù)比較

兩組組內(nèi)及組間各時間點外周血淋巴細胞總數(shù)無差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組外周血淋巴細胞測定結(jié)果(±s)×109L－1

表1 各組外周血淋巴細胞測定結(jié)果(±s)×109L－1

組 別 不同時間點淋巴細胞總數(shù)D0 D7 M6 M12疫苗組2.04±0.57 1.95±0.49 2.04±0.39 2.01±0.42胸腺肽組1.97±0.65 1.93±0.38 1.98±0.36 1.87±0.31

2.2 兩組不同時間點血清IL-2水平的比較

疫苗組在注射后6個月IL-2水平升高，與注射前、注射后7 d相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);注射后12個月IL-2水平恢復(fù)至注射前水平，與注射后6個月相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。胸腺肽組IL-2水平在注射后7 d開始升高(P＜0.01)，7 d與6個月差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);注射后12個月下降至注射前水平，與注射后7 d、6個月比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。兩組間IL-2的水平在注射前、注射后6個月、12個月差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，注射后7 d胸腺肽組IL-2水平與疫苗組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組不同時間點 IL-2水平的比較(±s，n=50) pg·ml－1

表2 兩組不同時間點 IL-2水平的比較(±s，n=50) pg·ml－1

與同組M6比較，a P＜0.01;與同組D7及M6比較，b P＜0.01;與疫苗組同時點比較，c P＜0.01

組 別不同時間點IL-2的水平D0 D7 M6 M12疫苗組 62.00±13.07a 59.83±8.35a 70.76±12.44 60.26±13.10a胸腺肽組 59.79±15.50b 65.53±14.00c 70.27±11.90 58.70±17.03b

2.3 兩組不同時間點IFN-γ水平的比較

疫苗組IFN-γ水平在注射后7 d明顯升高，與注射前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，注射后6個月與注射后7 d相比，IFN-γ水平有所下降(P＜0.05)，注射后12個月降至注射前水平。胸腺肽組注射后7 d及6個月，IFN-γ水平明顯升高(P＜0.01)，注射后12個月恢復(fù)至注射前水平。胸腺肽組IFN-γ水平在注射后7 d明顯高于疫苗組(P＜0.05)，其它時間點兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 兩組不同時間點IFN-γ的比較(±s，n=50)pg·ml－1

表3 兩組不同時間點IFN-γ的比較(±s，n=50)pg·ml－1

與同組D7比較，a P＜0.01，b P＜0.05;與同組M6比較，c P＜0.05;與同組D7、M6比較，d P＜0.01;與疫苗組同時點比較，e P＜0.05

組 別不同時間點IFN-γ水平D0 D7 M6 M12疫苗組 15.35±3.03ac 17.92±2.66c 16.67±3.50b 14.72±2.91ac胸腺肽組 15.49±1.85d 19.05±2.73e 16.57±2.24 14.90±1.98d

2.4 兩組不同時間點抗狂犬中和抗體水平的比較

兩組組內(nèi)各時間點比較，中和抗體水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);胸腺肽組在注射7 d時中和抗體水平明顯高于疫苗組(P＜0.01)，在注射后6個月和12個月與疫苗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表4 兩組不同時間點抗狂犬病中和抗體水平的比較(±s，n=50) IU·ml－1

表4 兩組不同時間點抗狂犬病中和抗體水平的比較(±s，n=50) IU·ml－1

同組不同時點相比，a P＜0.01;與疫苗組同時點相比，b P＜0.01

組 別 不同時間點中和抗體水平D7 M6 M12疫苗組 0.46±0.11a 4.07±1.13a 0.68±0.38a胸腺肽組 0.51±0.13ab 4.55±1.37a 0.72±0.21a

在注射后7 d疫苗組中和抗體水平＞0.5 IU·ml-1病例數(shù)為3例，胸腺肽組為10例，胸腺肽組抗體產(chǎn)生率高于疫苗組(χ2=4.33，P＜0.05)。在注射后6個月兩組都能產(chǎn)生有效抗體，陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，12個月時抗體都有下降，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 IL-2、γ-IFN和中和抗體的動態(tài)變化

兩組體內(nèi)IL-2水平在注射后7 d開始上升，到6個月時進一步上升，到12個月時基本恢復(fù)正常，見圖1。

圖1 兩組血清IL-2水平的動態(tài)變化

兩組體內(nèi)IFN-γ在注射后7 d上升明顯，到6個月時仍高于接種前，到12個月時恢復(fù)正常，見圖2。

圖2 兩組血清IFN-γ水平的動態(tài)變化

兩組中和抗體在接種后7 d即有上升，6個月時最高，12個月時下降明顯，但高于7 d時的水平，見圖3。

圖3 兩組血清中抗狂犬中和抗體水平的動態(tài)變化

2.6 中和抗體和其他指標的相關(guān)性

疫苗組中和抗體與IL-2水平的 Pearson值為0.395(P＜0.01)，與淋巴細胞總數(shù)的 Pearson值為0.146(P＞0.05)，與 IFN-γ的 Pearson值為0(P＞0.05)。

胸腺肽組中和抗體與IL-2水平的Pearson值為0.235(P＜0.01)，與淋巴細胞總數(shù)的Pearson值為0.022(P＞0.05)，與 IFN-γ的 Pearson值為 0.011(P ＞0.05)。

2.7 疫苗和胸腺肽的安全性評估

所有病例皆無明顯的不良反應(yīng)，注射部位紅腫23例(疫苗組11例，胸腺肽組12例)，低熱15例(疫苗組7例，胸腺肽組8例)，乏力12例(疫苗組7例，胸腺肽組5例)，無其他嚴重不良反應(yīng)，兩組比較不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討 論

研究顯示，狂犬病病毒暴露前免疫接種有利于狂犬病的預(yù)防［7］。對于狂犬病緊急暴露后的處理措施，目前降低暴露后人群發(fā)病最關(guān)鍵和最有效的方法就是實施暴露后狂犬疫苗免疫。患者在緊急狂犬病暴露時，尤其是明確的狂犬咬傷，要嚴格遵照動物咬傷的處理順序，局部傷口處理、疫苗接種和抗狂犬血清/免疫球蛋白缺一不可，Ⅱ級傷口使用狂犬疫苗，Ⅲ級傷口使用狂犬疫苗加抗狂犬免疫球蛋白。但盡管如此，在全國各地仍有嚴格按照預(yù)防接種程序處理后仍然發(fā)病的病例發(fā)生［8］，其中免疫功能低下［9］、有慢性消耗性疾病等都會影響抗體的產(chǎn)生［10］。在緊急暴露人群，特別是潛伏期較短者，如何使機體盡快產(chǎn)生抗狂犬病病毒的保護性中和抗體，或者在抗體產(chǎn)生前機體具有一定的抵抗力是直接關(guān)系到免疫成敗的關(guān)鍵。

胸腺肽是一種很好的免疫調(diào)節(jié)劑，主要增強機體的免疫功能，能連續(xù)誘導(dǎo)T淋巴細胞分化、成熟、發(fā)育，使CD4+T細胞數(shù)目增加;增強IL-2受體的表達，增強自然殺傷細胞的能力，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。不同劑量的胸腺肽對機體免疫功能的調(diào)節(jié)也不同，較低劑量產(chǎn)生免疫促進作用，較高劑量產(chǎn)生免疫抑制作用［11］。Cardenas等［12-13］研究發(fā)現(xiàn)在小鼠感染狂犬病模型中，胸腺是最易受傷的的淋巴器官，小鼠死亡前胸腺細胞呈現(xiàn)高水平的CD4或CD8表達，胸腺萎縮明顯，淋巴細胞凋亡。免疫低下或胸腺萎縮的人群接種疫苗效果較差［14］。史秀山等［4-5］使用小鼠研究發(fā)現(xiàn)加用單劑量胸腺肽(2 mg·只-1)后抗體效價高且抗體產(chǎn)生時間早，抗體水平高，減少免疫次數(shù);而使用轉(zhuǎn)移因子則只能增強狂犬病疫苗免疫的效果，不能減少免疫次數(shù)。我們使用單劑量(1 mg·kg-1)胸腺肽聯(lián)合狂犬病疫苗對Ⅱ級咬傷的狂犬病暴露后人群進行預(yù)防接種，動態(tài)觀察IL-2、INF-γ水平和中和抗體含量的變化，發(fā)現(xiàn)其能促進注射后7 d中和抗體的產(chǎn)生，但不能延緩抗體的有效保護時間。

IL-2可作用于T細胞、B細胞，調(diào)節(jié)B細胞的分化、增殖及功能，在疫苗接種產(chǎn)生相應(yīng)抗體的過程中起著重要作用［15］，如能夠降低免疫缺陷患者接種疫苗的副反應(yīng)，提高免疫的效果［16］，使小鼠產(chǎn)生抗體的時間提前，抗體效價高［17］;因此，接種狂犬疫苗后體內(nèi)IL-2的水平可以用于評價狂犬病疫苗的保護力［18］，犬接種狂犬病疫苗后體內(nèi)IL-2、IFN-γ水平皆出現(xiàn)明顯上升［19-21］。

在本次研究中，兩組接種疫苗后機體IL-2和IFN-γ水平皆有明顯上升，加用單劑量胸腺肽能增加接種7 d后的抗體含量，加快抗體產(chǎn)生的速度，對于狂犬病暴露者胸腺肽是安全的，可作為一種免疫增強劑用于狂犬病疫苗接種。

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