張濤，白芳云，白飛虎

(1.寧夏醫(yī)科大學，寧夏銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，寧夏銀川 750004)

血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解代謝過程中的限速酶，人體內(nèi)的CO主要是由HO代謝產(chǎn)生的。目前認為HO有3種形式:氧應(yīng)激誘導(dǎo)型(HO-1)、組成型(HO-2)及尚未明確的HO-3。HO-1是血紅素降解的一種限速酶，其將血紅素分解產(chǎn)生CO、Fe2+和膽綠素。研究表明，HO-1不僅在機體生理狀態(tài)下發(fā)揮作用，更主要的是在機體非正常狀態(tài)或應(yīng)激狀態(tài)中發(fā)揮作用。大量研究證實HO-1參與體內(nèi)各種氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎、抗凋亡及細胞保護作用［1］。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，HO-1與腫瘤增殖、血管發(fā)生、凋亡等生物學行為密切相關(guān)［2］。本實驗將通過構(gòu)建抑制HO-1表達的siRNA表達載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SCG7901細胞，利用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系并進行篩選鑒定，為進一步進行HO-1在腫瘤發(fā)生過程中可能存在的相關(guān)機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

感受態(tài)大腸桿菌E．coli DH5α和SGC7901細胞為第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院實驗室制備和保存;高保真PyrobestTMDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司;RTPCR反應(yīng)試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物公司;PCR引物由Invitrogen公司合成;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)液為Hyclone產(chǎn)品;新生牛血清購自杭州四季青責任有限公司;G418購自Amresco公司;DEPC購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;總RNA提取Trizol購自Promega公司;兔抗人HO-1單克隆抗體和兔抗人β-actin單克隆抗體購自EPITOMICS公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG-HRP購自TakaRa公司。

1.2 主要儀器

二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱:3110 SeriesⅡ水套，美國Thermo Scientific公司;超凈工作臺:單人單面VS-840-1，蘇州凈化設(shè)備儀器廠;倒置熒光顯微鏡:IXTIA22FL/PH，日本 Olympus。

1.3 表達載體的構(gòu)建和鑒定

參照本小組前期實驗［3］合成1條 HO-1小干擾RNA序列AACTTTCAGAAGGGCCAGGTG;將合成的目的基因片段與pEGFP-C1載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，提取質(zhì)粒用紫外分光計測定A260/A280值和濃度，內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，并送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序進一步驗證。按照相同的方法，制備1個陰性對照表達載體，序列為GTTCTCCGAACGTGTCACGTA。

1.4 G418篩選濃度的測定

將處于對數(shù)生長期的SGC7901細胞用胰酶消化吹懸后計數(shù)，按照每孔2 000個細胞接種于24孔板，加入含有不同濃度的G418的完全細胞培養(yǎng)液(濃度梯度為 0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 100 μg·ml-1)，并各做 1 個復(fù)孔，培養(yǎng)約 7 d后可見各組均有細胞死亡，培養(yǎng)14 d后可見600 μg·ml-1G418及更高濃度組細胞均死亡，而其他組雖也有細胞死亡但未完全死亡，因此確定G418篩選濃度為 600 μg·ml-1。

1.5 轉(zhuǎn)染和加藥篩選

細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃條件下、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h接種SGC7901細胞至24孔板，每孔細胞約2.0×105個，轉(zhuǎn)染時細胞融合度達到80% ～90%。按照Lipofectamine 2000說明書配制質(zhì)粒和脂質(zhì)體復(fù)合物，轉(zhuǎn)染體系為200 μl，每孔終體積為500 μl，放入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后換液，同時設(shè)立空白對照組以及陰性對照組，空白對照組以等量培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染體系，陰性對照組中加入陰性對照表達載體。轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h后加入含有G418的篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化

加壓篩選后，每3 d更換1次培養(yǎng)液，約20 d后開始出現(xiàn)細胞克隆，40 d后可見成簇生長的細胞零散在培養(yǎng)孔中，小心消化吹散使其在培養(yǎng)孔中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞長滿培養(yǎng)孔后獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作:預(yù)先對96孔板除第1排之外的所有孔加入100 μl培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1 ×106個·L-1，按 200 μl·孔-1接種于 96 孔板的第1排，從中吸取100 μl細胞液接種于第2排，混勻后，從第2排中吸取100 μl接種于第3排，直到第8排，最后1排均丟棄100 μl細胞液，待細胞貼壁生長后，倒置顯微鏡下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，約15 d后，挑選單克隆細胞株進行培養(yǎng)。

1.7 RT-PCR檢測HO-1轉(zhuǎn)錄水平的表達

用Trizol一步法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，進行PCR反應(yīng)。利用prime5.0軟件設(shè)計HO-1上下游引物，上游引物5'-GGAGGAGGAGATTGAGCG-3'，下游引物5'-GGATGTTGAGCAGGAACG-3'，擴增產(chǎn)物大小為452 bp。內(nèi)參基因GAPDH的上游引物5'-ATC ACCATCTTCCAGGAGCGA-3';下游引物5'-AGCCTTCT CCATGGTGGTGAA-3'，擴增產(chǎn)物大小為105 bp。擴增條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸 30 s，45個循環(huán)，最后 72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測HO-1翻譯水平的表達

用6MM培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，待細胞長滿后，預(yù)冷PBS洗2～3次，每個培養(yǎng)皿中加200 μl蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上作用5 min，超聲充分碎裂，4℃ 12 000 r·min-1離心5 min，用BCA法進行蛋白定量，再加入5×上樣緩沖液煮沸5 min，離心后-80℃凍存?zhèn)溆谩?0%SDS-PAGE電泳，恒流20 mA 60 min電泳，半干法進行轉(zhuǎn)膜20 V 25 min。用含10%脫脂奶粉的TBST室溫封膜1 h，按照1∶500封閉一抗4℃搖床過夜，次日室溫復(fù)溫1 h，TBST洗膜4次，每次4 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋度1∶1 500)，搖床70轉(zhuǎn)，室溫封閉1 h，TBST洗膜4次，每次4 min。ECL試劑暗室曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 酶切及測序結(jié)果

對提取的質(zhì)粒進行定量，濃度為 0.45 μg·μl-1，A260/A280=1.9，雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)錄水平的表達

采用RT-PCR檢測HO-1 mRNA表達水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染干擾載體的細胞表達水平明顯下調(diào)(圖2)。

圖2 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄水平的表達

2.3 翻譯水平的表達

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測HO-1蛋白表達水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染干擾載體的細胞表達水平明顯下調(diào)(圖3)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測翻譯水平的表達

3 討 論

脂質(zhì)體2000是一種陽離子制劑，其功能是通過與核酸復(fù)合發(fā)揮作用，使其能夠克服細胞膜的靜電作用而被細胞吸收，可以將核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)染進入絕大部分的細胞系中［4］。但是針對不同的細胞系，其轉(zhuǎn)染效率并不盡相同，有時候會表現(xiàn)得非常低，如果此時在瞬時轉(zhuǎn)染條件下進行相關(guān)實驗，結(jié)果往往不盡人意，有人已經(jīng)證明瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件下，對細胞所產(chǎn)生的影響并不相同［5］。相比而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染會比瞬時轉(zhuǎn)染帶來更好、更穩(wěn)定和更理想的實驗結(jié)果，所以我們有必要進行穩(wěn)定篩選來建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。

HO-1與腫瘤的關(guān)系日益受到關(guān)注，研究表明，與周圍的正常組織相比，HO-1 在肝癌［6］、黑素瘤［7］、前列腺癌［8］、Kaposi肉瘤［9］、胰腺癌［10］中表達上調(diào);而抑制HO-1的表達，利用錫原卟啉(SnPPIX)抑制HO-1的活性或siRNA靶向敲除HO-1表達的黑素瘤細胞增殖力缺失［7］，可降低胰腺癌、肺癌、肝癌的生長［11］。

本課題組前期的實驗研究已經(jīng)證明，HO-1與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密，尤其是在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的過程中，可能發(fā)揮著促進的作用［3，12］。為了進一步研究，我們建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HO-1小干擾RNA的細胞系，以明確HO-1與胃癌及其腹膜轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系以及可能存在的分子機制。

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