于 鈺，索 倫， 吳 強(qiáng)

(上海交通大學(xué) 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200240)

PCDHα在髓鞘形成和少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中的作用

于 鈺，索 倫， 吳 強(qiáng)*

(上海交通大學(xué) 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200240)

該文通過免疫組化及蛋白免疫印跡的方法分別對(duì)Pcdhα基因敲除和對(duì)照組小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的髓鞘堿性蛋白表達(dá)以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：1)Pcdhα基因缺失小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘堿性蛋白較對(duì)照組小鼠明顯減少；2)Pcdhα基因敲除可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常：在小腦中, 處于成熟期的少突膠質(zhì)細(xì)胞減少, 而處于前體細(xì)胞階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞增多。上述結(jié)果提示 Pcdhα可以通過調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟過程進(jìn)而影響髓鞘的形成。

原鈣黏蛋白；髓鞘；少突膠質(zhì)細(xì)胞；發(fā)育

Pcdh是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類跨膜蛋白, 根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分為非成簇原鈣黏蛋白(Nonclustered Pcdh)和成簇原鈣黏蛋白(Clustered Pcdh)。成簇Pcdh基因包含三個(gè)串聯(lián)的基因簇——Pcdhα、β和γ。其中Pcdhα和Pcdhγ分別由14和 22個(gè)可變區(qū)及各自共同的恒定區(qū)組成, 并通過基因的可變剪接編碼36種Pcdh分子, 而Pcdhβ則由 22個(gè)可變區(qū)進(jìn)行單獨(dú)編碼(Wu & Maniatis,1999)。多樣性的Pcdh分子通過同嗜或異嗜結(jié)合的方式特異性地表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞膜上, 并影響神經(jīng)細(xì)胞間的特異性鏈接(Weiner et al. 2005;Schreiner & Weiner, 2010; Takeichi, 2007)。Pcdh 分子還可以通過其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與其它胞內(nèi)蛋白相互作用,進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的存活(Emond & Jontes, 2008;Fernández-Monreal et al, 2009, Han et al, 2010)。

本課題組在前期的研究中對(duì)神經(jīng)元跨膜蛋白原鈣黏蛋白(Pcdhα)敲除小鼠的行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),該小鼠表現(xiàn)出典型的焦慮及強(qiáng)迫性抓撓行為, 致使頭頸部皮膚脫毛, 出現(xiàn)嚴(yán)重的非病理性皮膚損傷。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 該基因廣泛分布于神經(jīng)元的胞體及樹突膜上并可以明顯引起海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育異常和樹突棘減少, 最終嚴(yán)重阻礙了小鼠正常的神經(jīng)傳導(dǎo)通路(Preparation for publication)。脫髓鞘疾病多發(fā)性硬化癥和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良困擾人類很多年, 目前科學(xué)家還未發(fā)現(xiàn)能夠徹底治愈低髓鞘化疾病有效的方法。有研究表明, 在人類中幼兒時(shí)出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)低髓鞘化伴隨有Pcdhα突變(Shimojima et al, 2011)。然而,Pcdhα基因敲除小鼠是否影響髓鞘的形成, 以及該基因是通過何種途徑來調(diào)控髓鞘的發(fā)育目前還尚不清楚。

為此, 本研究以Pcdhα基因敲除小鼠為研究對(duì)象，通過免疫組化及蛋白生化分析的方法對(duì)Pcdhα基因敲除對(duì)小鼠髓鞘形成及與之密切相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育的影響進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Pcdhα基因敲除小鼠(Cre-Loxp系統(tǒng)敲除制備,Cre表達(dá)小鼠品系為C57BL6, 由本實(shí)驗(yàn)室提供, 遺傳背景為C57BL6)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫 (22士1)℃,自由攝食與飲水, 12h光照/12h黑暗期飼養(yǎng)。所有的實(shí)驗(yàn)都在遵循國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南的基礎(chǔ)上進(jìn)行。

一抗：Rat anti-Myelin Basic protein(Millipore),Rabbit Anti-NG2 chondroitin sulfate proteoglycan(Millipore), Mouse anti-O4(Millipore), Mouse GFAP antibody(Millipore), Mouse NF200 antibody (Millipore),Rabbit Tau antibody(Millipore), Rabbit polyclonal to βactin(Millipore)。

二抗：Donkey anti-mouse IgG Dylight 488(Jackson immuno Research), Goat anti-rat IgG-FITC(Invitrogen), IRDye 800 Goat Anti-Rat IgG(LI-COR Bioscience), IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG(LI-COR Bioscience), IRDye 800 Goat Anti-Mouse IgG(LI-COR Bioscience)。

1.2 基因型鑒定

鼠尾基因組DNA的PCR檢測(cè)：1) 按照常規(guī)方法進(jìn)行鼠尾基因組DNA的提取; 2) 采用如下引物及PCR程序進(jìn)行基因型鑒定：ConF1: AGGCT GAATAACGTGCACAGCTAAG; GFPmutF: CCCCC TGAACCTGAAACATAAAATG; ConR1: GCAGAT TGGTTCAATGGAGTCTTT。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃2 min; 94 ℃ 30 s, 59.5 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35 個(gè)循環(huán); 72 ℃ 3 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.3 免疫組化

分別取10、21日齡Pcdhα基因敲除小鼠和對(duì)照組小鼠各6只麻醉后，經(jīng)4%多聚甲醛灌注后完整取出小鼠腦組織置于 4%多聚甲醛溶液中 4℃固定過夜, 再分別經(jīng)15%和30%蔗糖溶液脫水處理至沉入瓶底后進(jìn)行常規(guī) OCT包埋及冰凍切片。根據(jù)小鼠大腦圖譜（Paxinos & Franklin, 2001），小鼠腦組織徑向連續(xù)切片(厚 30 μm)貼于載玻片上。免疫組織化學(xué)染色按照試劑盒進(jìn)行, 一抗（rat anti-myelin basic protein 1:500, rabbit anti-NG2 1:200, mouse anti-O4 1:50）孵育4 ℃過夜, 經(jīng)PBS充分漂洗后加入對(duì)應(yīng)二抗（goat anti rat FITC, 1:20, goat anti rabbit Alex488, 1:1 000, goat anti mouse Alex488,1:1 000）室溫下孵育1 h, DAPI溶液封片后在ZEISS熒光顯微鏡下進(jìn)行圖片采集。采集圖片在Axiovision Rel7.0軟件中進(jìn)行圖像分析。

1.4 Western blotting

分別取10、21日齡Pcdhα基因敲除小鼠與對(duì)照組小鼠脫頸處死, 在顯微鏡下快速將小腦, 腦干和大腦迅速分離后電子天平稱重, 按照每20 mg組織加入 100～200 μL裂解液的比例加入裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1%TritonX-100, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1%SDS, protease inhibitors cocktail)。組織破碎 5 min, 充分裂解后,14 000g離心3～5 min后取上清, 樣品進(jìn)行BCA法進(jìn)行蛋白定量后加入等體積的2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液, 95℃水浴加熱 3～5 min, 進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 轉(zhuǎn)膜處理。轉(zhuǎn)膜后NC膜用5%脫脂奶室溫封閉 1 h后在一抗中 4 ℃孵育過夜, 用TBST清洗5 min×3次, 室溫孵育熒光二抗1 h, 用TBST清洗5 min×3次, 最后用Odyssey紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描。

2 結(jié) 果

2.1 Pcdhα基因敲除對(duì)髓鞘形成的影響

中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘由70%脂質(zhì)和30%蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein, MBP）占蛋白部分的1/3，它不但是髓鞘的主要組成部分，還能起到穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的作用。因此，MBP的測(cè)定是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有無髓鞘缺失的重要的指標(biāo)。在正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，該蛋白在出生時(shí)主要在腦干處有少量表達(dá)，MBP表達(dá)量最高峰發(fā)生在小鼠出生21 d。此時(shí)，該蛋白不僅廣泛分布于小腦葉中，在大腦的胼胝體中也高度表達(dá)。由于可變剪切的作用MBP蛋白形成4個(gè)亞型。實(shí)驗(yàn)取同一窩出生的小鼠，通過PCR鑒定基因型，Pcdhα基因敲除雜合小鼠作對(duì)照組，Pcdhα基因敲除純合小鼠為實(shí)驗(yàn)組（圖1）。

本研究免疫組化染色結(jié)果表明：21日齡Pcdhα基因敲除純合小鼠髓鞘在腦干處的差異不明顯，但在小腦和大腦中髓鞘的形成呈現(xiàn)延遲的狀況(圖2)，在軸突束最為集中的胼胝體尤其顯著(圖2G, J)。

圖1 基因型鑒定結(jié)果Fig. 1 Genotyping results

圖2 21日齡純合小鼠與對(duì)照組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的髓鞘化的不同(10×)Fig. 2 Myelination differences on white matter of CNS between control and Pcdhα-/- mice(10×magnification)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究對(duì) 21日齡小鼠的大腦、小腦和腦干分別采集后進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示：MBP 4種亞型的蛋白量都出現(xiàn)不同程度地減少，尤其是在小腦和大腦中比較顯著(圖3), 驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果。所以，我們得出結(jié)論：Pcdhα敲除確實(shí)導(dǎo)致了小鼠髓鞘的形成缺陷。

2.2 Pcdhα基因敲除對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響

圖3 21日齡Pcdhα-基因敲除純合小鼠和對(duì)照組小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MBP的表達(dá)量差別Fig. 3 Difference in myelination revealed by MBP expression between control mice and Pcdhα-/- mice 21 day after birth

在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，髓鞘主要由成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞將細(xì)胞膜圍繞軸突多次螺旋纏繞壓縮形成。少突膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過多潛能神經(jīng)干細(xì)胞期、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞期、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞期和未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞期，最終發(fā)育成為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以發(fā)射出很多突起，分別包埋軸突，形成髓鞘 (Baumann &Pham-Dinh, 2001)。少突膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育不同階段特異性的表達(dá)不同蛋白，而整個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育又是伴隨著一些蛋白的消失和另外一些標(biāo)記蛋白的產(chǎn)生。其中NG2(CPSG4)是一類硫酸軟骨素蛋白多糖，主要在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中表達(dá)，而在成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞中消失。少突膠質(zhì)細(xì)胞開始成熟時(shí)，能夠大量合成硫脂和糖脂，從而可以被O4的抗體所識(shí)別。所以，可以分別用NG2和O4標(biāo)記少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。再次利用Pcdhα敲除的小鼠去探索少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，Pcdhα敲除小鼠小腦中少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(NG2+細(xì)胞)顯著增加(圖4A, B)。相反，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(O4+細(xì)胞)則明顯減少(圖 4C,D)。此外，Western blotting結(jié)果同樣表明，Pcdhα敲除小鼠小腦中少突膠質(zhì)前體細(xì)胞顯著增加(圖 4E)。

圖4 10日齡Pcdhα基因敲除純合小鼠與對(duì)照組小鼠在小腦處NG2著色和O4著色的細(xì)胞數(shù)目上呈現(xiàn)出不同的現(xiàn)象(10×)Fig. 4 Different phenotype of NG2 and O4 cell number in the cerebellum of Pcdhα-/- and control mice 10 days after birth (10×magnification)

2.3 Pcdhα基因敲除引起的與髓鞘相關(guān)水平的變化

星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于髓鞘外部環(huán)境的維護(hù)起到重要作用(Ishibashi et al, 2006)。此外，髓鞘形成的延遲或脫髓鞘化小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)經(jīng)常伴隨著軸突的損傷、變性或消失(Fancy et al, 2011)。本課題組采集 21日齡小鼠大腦進(jìn)行蛋白免疫印跡，結(jié)果顯示，Pcdhα基因敲除對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白（GFAP）以及軸突標(biāo)記蛋白（NF200和Tau）均無顯著影響（圖5）。

圖5 Pcdhα基因敲除對(duì)小鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和軸突的影響Fig. 5 Effect of Pcdhα gene knockout on axonal and astrocyte protein markers in the mouse cerebrum

3 討 論

Pcdhα基因敲除小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在普遍的低髓鞘化現(xiàn)象，與此同時(shí)也伴隨著大量少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的聚集，但成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目卻有減少的趨勢(shì)。由于只有成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞才具有形成髓鞘的潛能，大量存在的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體有可能導(dǎo)致了小鼠的低髓鞘現(xiàn)象。我們的結(jié)論是Pcdhα的確在少突膠質(zhì)細(xì)胞前體到成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的這個(gè)階段中起作用。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示,在個(gè)體成熟的基因敲除小鼠中，軸突沒有因?yàn)榈退枨驶霈F(xiàn)變性，消失或損傷的表型。這可能是由于在成年P(guān)cdhα基因敲除小鼠體內(nèi)存在某種能使軸突再髓鞘化的信號(hào)，從而吸引更多的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體能夠再次聚集到低髓鞘化的軸突上。然而，由于Pcdhα基因的缺失，這些前體細(xì)胞無法發(fā)育成具有形成髓鞘功能的少突膠質(zhì)細(xì)胞。所以，本項(xiàng)研究為將來基因治療人類脫髓鞘疾病提供了依據(jù)。

致謝：感謝上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院李偉老師在實(shí)驗(yàn)上的幫助, 感謝魯慧囡、陸宇嘉同學(xué)在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上給予的建議。

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Protocadherin α gene cluster is required for myelination and oligodendrocyte development

YU Yu, SUO Lun, WU Qiang*

(Shanghai Center for Systems Biomedicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai200240,China)

This work used Immunohistochemistry to examine the expression of myelin basic protein and accumulation of oligodendrocytes inPchdαknockout and control littermate mice. Data showed that inPchdαknockout mice, Myelin proteins decrease in the central nervous system and mature oligodendrocytes in the cerebellum also decrease. Furthermore, deletion of the Pcdhα cluster does not cause any change to the axons and astrocytes in quantification of relative marker proteins. These findings suggest that the Pcdhα cluster may be required for myelination and oligodendrite development of the brain in mice, and that Pcdhα cluster may play a key role in the development of the central nervous system.

Protocadherin; Myelin; Oligodendrocyte; Development

Q952.5; Q42

A

0254-5853-(2012)04-0362-05

10.3724/SP.J.1141.2012.04362

2012-04-20；接受日期：2012-07-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171015)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: qwu123@gmail.com

于鈺(1985—), 女, 碩士研究生, 研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué), E-mail: sduyuyu@yahoo.com.cn