楊云鵬, 管小琴, 祁明美, 朱良榮

(重慶醫(yī)科大學(xué) 病理教研室, 分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心, 重慶 400016)

抵抗素對NAFLD肝纖維化的影響及可能的體內(nèi)外機制

楊云鵬, 管小琴*, 祁明美, 朱良榮

(重慶醫(yī)科大學(xué) 病理教研室, 分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心, 重慶 400016)

應(yīng)用高脂飲食飼養(yǎng)Wistar大鼠建立非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）肝纖維化體內(nèi)模型, 選用重組抵抗素作用于肝星狀細胞(hepatic stellate cell-t6, HSC-T6)建立體外模型。觀察肝組織纖維化的情況；檢測體內(nèi)體外Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(CIV)、層黏蛋白(LN)水平；檢測肝組織抵抗素mRNA和蛋白的表達水平；檢測HSC-T6中轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGF-β1) mRNA及腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達水平。結(jié)果顯示, 隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長, 大鼠肝組織抵抗表達逐漸增加且纖維化程度逐漸加重; 隨著抵抗素濃度的增加, HSC-T6上清中纖維化指標升高, 細胞中TGF-β1 mRNA及TNF-α mRNA表達增加。與對照組比較, 各指標差異均有顯著性(P<0.05或0.01)。上述結(jié)果顯示抵抗素通過TNF-α、TGF-β1誘導(dǎo)NAFLD肝纖維的發(fā)生和發(fā)展。

抵抗素; 非酒精性脂肪肝; 纖維化; 腫瘤壞死因子α

2002 年，美國肝臟病學(xué)會非酒精性脂肪性肝炎專題研討會認為NAFLD (non-alcoholic fatty liver disease)是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn) (Neuschwander-Tetri & Caldwell, 2003), 其病理過程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化, 后期可發(fā)展為肝細胞癌和失代償性肝病(Adams et al, 2005)。以肝纖維化為主要特征的NASH是NAFLD進展的重要中間階段, 也是隱源性肝硬化的重要病因。在此階段經(jīng)積極治療病情可穩(wěn)定或在一定程度上好轉(zhuǎn), 但當繼續(xù)發(fā)展即可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化，甚至肝癌(Castera, 2008)。肝纖維化是肝臟對多種病因慢性刺激所致?lián)p傷后的修復(fù)反應(yīng), 其特征是以Ⅰ型膠原為主的細胞外基質(zhì)(EMC)的過度沉積。HSC(hepatic stellate cell)是產(chǎn)生EMC的主要細胞, HSC的活化是纖維生成的關(guān)鍵。抵抗素為新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子,有研究認為抵抗素與炎癥密切相關(guān)(Lee et al,2009)。目前, 抵抗素與NAFLD發(fā)生和發(fā)展關(guān)系尚存在許多爭議, 其是否可通過炎癥機制參與肝纖維化進展研究甚少。

本實驗通過高脂喂養(yǎng)大鼠模擬 NAFLD模型,觀察抵抗素與肝纖維化關(guān)系，并通過體外細胞實驗,應(yīng)用抵抗素作用于與肝纖維化密切相關(guān)的 HSC-T6(hepatic stellate cell-t6), 探討抵抗素與炎癥及肝纖維化的關(guān)系及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性 Wistar大鼠 24只, 體重為（200±20）g (由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。實驗動物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組(9只)和模型組(15只), 分籠飼養(yǎng)。對照組給予基礎(chǔ)飼料, 模型組給予改良高脂飼料(Wang & Guan, 2007)。根據(jù)預(yù)實驗觀察于 15周出現(xiàn)較理想的纖維化趨勢, 本實驗分別于15、18、21周末處理對照組(各3只)和模型組(各 5 只)。

1.2 培養(yǎng)細胞

HSC-T6由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化研究室惠贈。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng) HSC-T6細胞, 細胞長滿培養(yǎng)瓶 75%后傳代,待貼壁后分4組：A組(1640培養(yǎng)液); B、C和D組分別于 1640培養(yǎng)液中加入不同濃度抵抗素25 μg/ L、50 μg/ L 和 100 μg/ L, 各組細胞分別培養(yǎng)72 h后, 進行各項實驗指標的檢測。

1.3 主要試劑

PRMI-1640、胰酶購自中國重慶百杰生物有限公司; 胎牛血清購自中國杭州四季青生物公司; 重組抵抗素購自中國重慶博培生物技術(shù)有限公司; 總RNA提取試劑BioZol購自中國重慶升博科技有限公司; reverse transcription-PCR (RT-PCR)試劑盒購自中國成都天泰生物技術(shù)有限公司; 蛋白提取試劑盒購自中國江蘇碧云天生物技術(shù)研究所; 抵抗素抗體購自中國重慶百杰生物有限公司代理; β-actin、辣根過氧化物酶標記的IgG購自中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 標本采集

處理前大鼠禁食12 h, 用3.5%的水合氯醛腹腔麻醉(1 mL/100 g體重), 眼球取血并分離血清,－80 ℃冰箱保存。剖腹取肝臟組織, 取相同部位肝組織(1 cm×1 cm×0.3 cm)浸泡入10%中性甲醛溶液固定, 備常規(guī)石蠟包埋切片VG染色作光鏡標本; 另取相同部位肝組織(～0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm, 數(shù)枚)。戊二醛固定制備電鏡標本。其他操作由重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室完成。其余的肝組織置于液氮罐中凍存。

1.5 動物血清、體外細胞上清纖維化指標檢測

酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒檢測各實驗組血清、體外細胞上清中Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層黏蛋白(LN)水平, 按照試劑盒說明書操作。

1.6 RT-PCR法檢測大鼠肝組織中抵抗素、HSC-T6的TGFβ-1 mRNA及TNF-a mRNA表達水平

按 TRIzol試劑說明書提取肝組織和細胞總RNA。分光光度計于260 nm波長測RNA含量。取2 g總RNA為模板, 按照RT-PCR試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。各引物序列見表1。

表1 本研究中的RT-PCR引物序列Tab. 1 RT-PCR primers sequence in the study

內(nèi)參β-actin 1基因擴增條件為：94 ℃ , 3 min;94 ℃ , 30 s, 56 ℃ , 30 s, 72 ℃ , 1 min,共30個循環(huán);72 ℃, 5 min。抵抗素基因擴增條件為：94 ℃, 3 min;94 ℃ , 30 s, 54 ℃ , 30 s, 72 ℃ , 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ , 5 min。β-actin 2 基因和TGFβ-1基因擴增條件為：94 ℃ , 3 min; 94℃ , 30 s, 58 ℃ , 30 s, 72 ℃, 1 min, 共30個循環(huán); 72 ℃ , 5 min。TNF-α基因擴增條件為：94 ℃, 3 min; 94℃ , 30 s, 55 ℃ , 30 s, 72 ℃,1 min, 共 30個循環(huán); 72 ℃ , 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓 100 V, 20 min), 用Quantity One軟件成像及定量分析, 以各目的基因與內(nèi)參基因光密度的比值示其相對含量。

1.7 Western blotting法檢測大鼠肝組織中抵抗素

蛋白水平的表達

提取肝組織蛋白, 并采用Bradford法進行蛋白定量。取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)電泳, 轉(zhuǎn)膜, 用脫脂奶粉稀釋抵抗素一抗, 4 ℃孵育過夜, 室溫下孵育相應(yīng)二抗60 min, 發(fā)光, 應(yīng)用Quantity One軟件成像及定量分析, 以各目的基因與內(nèi)參基因光密度的比值示其相對含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示, 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析, 組間比較用t-檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學(xué)改變

較正常對照組, 15～18周NAFLD模型組大鼠可見肝組織纖維組織增生, 21周NAFLD模型組大鼠肝組織纖維明顯增生致匯管區(qū)擴大并局部形成纖維條索 (圖 1A)。電鏡觀察見肝細胞胞漿中見較多脂質(zhì)空泡。狄氏間隙內(nèi)膠原原纖維增生, HSC(hepatic stellate cell)胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡明顯減少，甚至消失(圖 1B)。

2.2 血清纖維化指標檢測結(jié)果

與對照組比較, PCⅢ、HA、CIV、LN均隨著高脂喂養(yǎng)大鼠時間的延長而逐步升高, 并且在 21

圖1 21周模型組肝組織纖維化VG染色(×400)(A)和肝星狀細胞電鏡(×8 000)(B)Fig. 1 VG staining of liver fibrosis (×400)(A) and electron microscopy of hepatic stellate cells (×8 000)(B)for the 21 weeks model group

周時各指標升高最為顯著。各時相模型組與對應(yīng)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)(表 2)。

表2 大鼠血清纖維化譜的變化和肝組織抵抗素基因和蛋白表達Tab. 2 Spectrum of changes in serum fibrosis and liver tissue resistin gene and protein expression

2.3 大鼠肝組織中抵抗素基因和蛋白的表達

與對照組比較, 各時相模型組大鼠肝組織中抵抗素基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高, 且以 21周升高最為明顯, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(圖 2A 和表2)大鼠肝組織中抵抗素蛋白表達趨勢與抵抗素基因轉(zhuǎn)錄水平趨勢相一致(圖2B和表2)

2.4 體外細胞上清纖維化指標檢測

隨著重組抵抗素濃度的增加, 纖維化譜各指標逐漸增加。與對照組比較, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (表 3)。

2.5 細胞 TGFβ-1 mRNA 及 TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平

RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：與A組比較,隨著加入抵抗素濃度的增加, TGFβ-1及 TNF-α mRNA表達水平升高, 且以D組表達水平最高, 差異具有顯著性(P<0.05)(圖3和表3)。

圖2 各組抵抗素的mRNA表達的RT-PCR(A)和蛋白表達(B)的檢測結(jié)果Fig. 2 Results of mRNA expression by RT-PCR (A) and protein expression (B) for each group of resistin

表3 細胞上清纖維化指標變化及細胞TGFβ-1mRNA、TNF-α mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平Tab. 3 Cell supernatant fibrosis indexes and gene transcription level of TGFβ-1 mRNA, TNF-α mRNA

圖3 TGFβ-1(A)和 TNF-α(B)各組 mRNA 表達的RT-PCR檢測結(jié)果Fig. 3 mRNA expression by RT-PCR for each group of TGFβ-1(A) and TNF-α(B)

3 討 論

HSC又稱Ito細胞、維生素A儲存細胞、竇周細胞等, 在生理狀態(tài)下 HSC位于肝索與肝竇壁之間的狄氏間隙內(nèi)。HSC分布廣泛, 形態(tài)不規(guī)則, 常伸出樹狀突起, 包繞5～6個肝細胞, 因此得名為肝星狀細胞。在肝纖維化形成初期, HSC即被激活轉(zhuǎn)化為myofibroblast, 產(chǎn)生多種ECM組分, 是形成肝纖維化主要的細胞(Wells, 2008)。

抵抗素是新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子, Szalowska et al(2009)發(fā)現(xiàn)抵抗素不僅表達于脂肪組織, 在肝臟中也表達, 且表達量高于脂肪組織。其與 NAFLD纖維化的關(guān)系尚存在爭議, 其作用機制研究甚少。

本課題通過高脂飲食喂養(yǎng)大鼠建立NAFLD模型, 實驗結(jié)果顯示, 從血清學(xué)上分析：與對照組比較, PCⅢ、HA、CIV、LN均隨著高脂喂養(yǎng)大鼠時間的延長而逐步升高, 并且在 21周時各指標升高最為顯著。各時相模型組與對應(yīng)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01, 表 2)。從組織學(xué)上觀察：較正常對照組, 15～18周NAFLD模型組大鼠可見肝組織纖維組織增生, 21周NAFLD模型組大鼠肝組織纖維明顯增生致匯管區(qū)擴大并局部形成纖維條索(圖1A)。電鏡觀察見肝細胞狄氏間隙內(nèi)有大量膠原原纖維形成，還可見 HSC(圖 1B)。HSC又是形成肝纖維化的主要細胞。這表明, 隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長, 血清學(xué)及組織學(xué)均顯示纖維化程度逐漸加重。同時, 本實驗對抵抗素的研究結(jié)果顯示：與對照組比較, 各時相模型組大鼠肝組織中抵抗素基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高, 且以 21周升高最為明顯, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2A和表2)。大鼠肝組織中抵抗素蛋白表達趨勢與抵抗素基因轉(zhuǎn)錄水平趨勢相一致(圖2B和表2)。

這表明, 隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長, 大鼠肝臟內(nèi)的抵抗素濃度越來越高。提示抵抗素與肝纖維化密切相關(guān)。

抵抗素與肝纖維化之間的關(guān)系是怎樣的；是通過什么機制來誘導(dǎo)肝纖維化的呢，為此，我們做了體外實驗予以研究。

我們選用不同濃度重組抵抗素直接作用于HSC-T6 ,能夠排除其他因素對機體影響, 使抵抗素作為獨立因素作用于 HSC-T6, 探討抵抗素對肝纖維化的可能作用機制。實驗結(jié)果顯示, 隨著重組抵抗素濃度的增加, 纖維化譜 PCⅢ、HA、CIV、LN逐漸增加。與對照組比較, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (表3)。這表明隨著重組抵抗素濃度的增加,肝纖維化程度加重。RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：與 A組比較, 隨著加入抵抗素濃度的增加,TGFβ-1 mRNA及TNF-α mRNA表達水平升高, 且以 D組表達水平最高, 差異具有顯著性(圖 3和表3)。由此推測抵抗素可能通過TGFβ-1和TNF-α 誘導(dǎo)NAFLD肝纖維化發(fā)生發(fā)展。

有研究發(fā)現(xiàn)肝硬化者的血清抵抗素水平較健康者明顯升高，且與肝臟炎癥和纖維化程度呈正相關(guān)(Kakizaki et al, 2008; Pagano et al, 2006)。 Fu et al(2006)將重組人抵抗素加入到人和鼠的巨噬細胞,導(dǎo)致促炎因子TNF-α的分泌升高, 提示抵抗素具有促炎作用。TNF-α等炎癥細胞因子通過正反饋調(diào)節(jié)激發(fā)抵抗素的生成, 即抵抗素與 TNF-α相互協(xié)同,促發(fā)炎癥瀑布反應(yīng)。TNF-α是最早發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)肝細胞損傷的脂肪因子, 在局部脂肪組織中的表達與肥胖程度成正相關(guān)(Fantuzzi, 2005)。肝臟是TNF-α重要的靶器官。Kitamura et al (2002)證實TNF-α是通過與受體的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。已知TNF-α的受體是由不同基因編碼的相對分子量為 5.5×104的TNF受體(TNF-Rp55)和相對分子質(zhì)量為7.5×104的TNF受體(TNF-Rp75)。TNF-Rp55表達于近乎所有的體細胞中, 但 TNF-Rp75則主要表達于粒細胞和上皮細胞。Tomita et al (2006)研究發(fā)現(xiàn), 在 MCD(methionine and choline deficient)喂養(yǎng)鼠中, Kuppfer細胞和內(nèi)皮細胞中血管細胞黏附分子——1(VCAM-1)和VCAM -2的表達上調(diào)可導(dǎo)致TNF-α從kuppfer細胞釋放增加, 表明TNF-Rp55是TNF-α在多種類型細胞中的主要信號受體。通過研究TNF-α/TNF-Rp55信號在肝纖維化過程中的病理生理作用, 認為TNF- Rp55介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可調(diào)節(jié) kuppfer細胞的活化, 并最終促進肝纖維化的進展, 而對TNF- Rp55受體的封閉作用可改善肝纖維化。TNF-α參與肝纖維化的可能機制有：1) 增加肝臟內(nèi)的脂質(zhì)合成; 2) 增加激素敏感性脂肪酶活性來促進脂肪動員, γ抑制脂蛋白脂肪酶的活性使脂肪組織貯存脂肪酸減少; 3) 血漿中的游離脂肪酸升高,而FFA的升高又可以通過溶酶體途徑使TNF-α的表達增加, 形成惡性循環(huán), 從而引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常、氧化應(yīng)激、脂肪酸β氧化超載, 最終導(dǎo)致脂肪在肝臟中沉積; 4) 活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK和JNK通路, 促進HSC產(chǎn)生ECM; 5) 可刺激HSC表達基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 (TIMP -1), 減少ECM的降解。

Tian et al (2003)研究還發(fā)現(xiàn), TNF-α還能間接誘導(dǎo)其他促纖維化因子的作用, 如IL-1和IL-6等。這些因子, 一方面促進局部炎癥反應(yīng), 使肝組織不斷受損；另一方面促進成纖維細胞和間質(zhì)細胞的增殖和分化, 維持肝組織損傷與修復(fù)循環(huán), 結(jié)果使更多的間質(zhì)細胞參與并產(chǎn)生大量 ECM, 從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

TGFβ-1是肝纖維化形成過程中的重要始動因子, 是目前已知最強的促肝纖維化細胞因子,TGFβ-1對HSC的活化是肝纖維化發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)(Gressner & Weiskirechen, 2006)。TGFβ-1 通過TGFβ/Smad信號傳導(dǎo)通路促進 HSC激活, 轉(zhuǎn)化為myofibroblast, 誘導(dǎo)活化的HSC收縮, 在HSC活化早期刺激ECM的合成與沉積, 造成惡性循環(huán), 促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展(Thenappan et al, 2010)。

綜上所述, 抵抗素通過TNF-α參與的炎癥機制以及 TGFβ-1對肝纖維化的作用誘導(dǎo)NAFLD纖維化的發(fā)生與發(fā)展。抑制肝臟慢性炎癥或者阻止抵抗素促炎機制, 有可能成為抑制 NAFLD肝纖維化發(fā)生發(fā)展的治療新思路。

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Effects of resistin on hepatic fibrosis: Possible mechanisms in non-alcoholic fatty liver disease inin vitroandin vivo

YANG Yun-Peng, GUAN Xiao-Qin*, QI Ming-Mei, ZHU Liang-Rong
(Department of Pathology,Chongqing Medical University,Molecular Medicine and Cancer Research Center of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China）

To investigate the effects and possible mechanisms of resistin on hepatic fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease, this review used anin vivomodel utilizing Wistar rats with a high fat diet. Recombinant resistin was selected to play role in hepatic stellate cells in the HSC-T6 cell line. We observed the degrees of hepatic fi brosis,measured the levels of Liver fibrosis spectrum and detected expression levels of resistin mRNA and protein in liver tissue as well as the expression levels of TGFβ-1 and TNF-α mRNA in HSC-T6. The results showed that expression of resistin in rat liver tissue and the degree of hepatic fibrosis increased over time with a high fat diet. Along with the increased concentration of resistin and levels of fibrosis index, TGFβ-1and TNF-α also increased in HSC-T6 cells. Compared with the control group, significant differences were found between each group, suggesting resistin by proinflammatory cytokine TNF-α and TGF-β1 induced the occurrence and development of NAFLD in hepatic fibrosis.

Resistin; NAFLD; Hepatic fibrosis; TNF-α

R589.2；R575.5

A

0254-5853-(2012)04-0367-06

10.3724/SP.J.1141.2012.04367

2012-03-05；接受日期：2012-06-05

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究資助項目(KJ090327)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: guanxiaoqin2003@yahoo.com.cn

男, 碩士研究生。主要研究方向為肝臟病理。Email:929494606@qq.com