李忻怡, 林浴霜, 張紅衛(wèi)

(1. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710062; 2. 山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 濟(jì)南 250100)

文昌魚(yú)tropomyosin基因的克隆、進(jìn)化分析及其胚胎發(fā)育與成體中的表達(dá)模式

李忻怡1,2,*, 林浴霜2, 張紅衛(wèi)2

(1. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710062; 2. 山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 濟(jì)南 250100)

Tropomyosin是一種分布廣泛而且在進(jìn)化上十分保守的蛋白, 是肌肉形成和收縮過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)得到文昌魚(yú)tropomyosin基因全長(zhǎng), 編碼一個(gè)含284個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì), 將文昌魚(yú) Tropomyosin和在其他物種中的同源物進(jìn)行比對(duì)建樹(shù), 發(fā)現(xiàn)其在功能域上高度保守并且只有一個(gè)拷貝, 符合動(dòng)物分類(lèi)學(xué)中各物種的進(jìn)化地位。胚胎整體原位雜交實(shí)驗(yàn)得知,tropomyosin在文昌魚(yú)早期發(fā)育的表達(dá)，最早從原腸胚末期神經(jīng)胚早期開(kāi)始, 定位于分化中的中內(nèi)胚層。到神經(jīng)胚期,tropomyosin的表達(dá)出現(xiàn)在發(fā)育中的體節(jié)和脊索中。隨著發(fā)育的進(jìn)行,tropomyosin的表達(dá)穩(wěn)定地集中在體節(jié)、脊索處。到72 h幼蟲(chóng)階段,tropomyosin的表達(dá)仍然在肌節(jié)內(nèi)。成體的切片原位雜交結(jié)果顯示,tropomyosin在肌節(jié)中的表達(dá)大幅度下調(diào), 而在神經(jīng)管細(xì)胞、脊索和腮區(qū)腮瓣處仍然可以檢測(cè)到明顯的表達(dá), 在外胚層和表皮內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雜交信號(hào)。研究結(jié)果表明,tropomyosin的表達(dá)與文昌魚(yú)肌節(jié)、肌肉以及神經(jīng)索的發(fā)生相關(guān), 參與文昌魚(yú)胚胎軀體模式的構(gòu)建, 而且在成體的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

文昌魚(yú); 進(jìn)化分析; 胚胎發(fā)育; 表達(dá)圖式; Tropomyosin

肌肉是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)的組織之一。研究肌肉的發(fā)生機(jī)制是了解胚胎發(fā)育中細(xì)胞命運(yùn)的決定、分化及器官形成的重要途徑。研究文昌魚(yú)肌肉發(fā)育過(guò)程, 有助于闡明脊椎動(dòng)物肌肉發(fā)生的機(jī)制。

從胚胎發(fā)育過(guò)程來(lái)看文昌魚(yú)具有和脊椎動(dòng)物一樣的分節(jié)過(guò)程。原腸運(yùn)動(dòng)后, 脊椎動(dòng)物 (爪蛙除外) 胚胎的肌肉發(fā)生也是從位于脊索兩側(cè)的近軸中胚層按從前到后的順序分節(jié) (segmentation)、成團(tuán),逐漸形成一定數(shù)目的體節(jié) (somites), 再由體節(jié)分化出3種不同的組織：生骨節(jié)、生肌節(jié)、生皮節(jié), 將來(lái)分別生成骨骼、肌肉以及真皮和結(jié)締組織 (Mei& Ding,1999)。

從分子水平上看，有相同的基因和蛋白參與了文昌魚(yú)和脊椎動(dòng)物的肌肉發(fā)育過(guò)程，如堿性肌球蛋白輕鏈和肌動(dòng)蛋白不僅存在于脊椎動(dòng)物中, 也同樣存在于文昌魚(yú)中 (Holland, 1995; Kusakabe, 1997)。MyoD、Myf5、肌細(xì)胞生成素 (myogenin) 和MRF4是控制脊椎動(dòng)物肌肉細(xì)胞決定和分化的關(guān)鍵因子(Braun et al, 1989; Davis et al, 1987; Simon &Konieczny, 1989; Wright et al, 1989; Yun, 1996), 能激活一系列肌肉專(zhuān)一因子的表達(dá), 從而促使細(xì)胞向肌細(xì)胞方向分化。作為一種最接近脊椎動(dòng)物的頭索動(dòng)物, 文昌魚(yú)在其基因組中有兩個(gè)生肌bHLH基因片段 (Araki, 1994, 1996; Beach, 1999; Meedel,1997)。對(duì)兩個(gè)文昌魚(yú) MyoD基因家族基因AmphiMRF1和AmphiMRF2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)兩者最初均在近軸中胚層中表達(dá), 其中AmphiMRF1的表達(dá)時(shí)間比AmphiMRF2稍晚(Schubert et al, 2003)。

脊索是脊椎動(dòng)物門(mén)胚胎的一個(gè)中軸性結(jié)構(gòu)。在較高等的脊椎動(dòng)物中, 脊索是一個(gè)瞬時(shí)存在的結(jié)構(gòu),它定位于胚胎的中間, 與背腹軸與左右的軸極性形成相關(guān)。脊索產(chǎn)生一些分泌因子, 給其周?chē)慕M織以信號(hào), 提供其定位和命運(yùn)分化的信息 (Christ et al, 2004; Danos & Yost, 1995; Fouquet et al, 1997;Goldstein & Fishman, 1998; Lohr et al, 1997;Munsterberg & Lassar, 1995; Pourquié et al, 1993;Yamada et al, 1991, 1993)。作為一個(gè)組織, 脊索和軟骨的結(jié)構(gòu)很接近, 看起來(lái)近似軟骨的原始形式。因此, 脊索一直支撐胚胎結(jié)構(gòu)直至其他組織的形成；而在一些脊椎動(dòng)物的進(jìn)化分支上,比如無(wú)顎類(lèi)脊椎動(dòng)物 (七鰓鰻)、遠(yuǎn)古魚(yú)類(lèi) (sturgeon鱘魚(yú)) 等, 脊索在一生中都存在。在較高等脊椎動(dòng)物中, 脊索在椎骨中骨化, 對(duì)椎骨之間的集中起作用, 存在于稱(chēng)之為nucleus pulposis的結(jié)構(gòu)中。

肌肉的收縮是通過(guò)細(xì)胞內(nèi) Ca離子濃度來(lái)調(diào)節(jié)的。在脊椎動(dòng)物中的調(diào)節(jié)機(jī)制，肌肉的收縮是通過(guò)細(xì)胞內(nèi) Ca離子濃度來(lái)調(diào)節(jié)的。在脊椎動(dòng)物中的調(diào)節(jié)機(jī)制是可以分為actin調(diào)節(jié)和myosin調(diào)節(jié)的。條紋肌的收縮主要是通過(guò) actin調(diào)節(jié), 而平滑肌的收縮主要是通過(guò)myosin調(diào)節(jié)。Tropomyosin的作用是調(diào)節(jié)actin－myosin的相互作用并且使actin的結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定，但其潛在的生化機(jī)制并不是很清楚。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在心肌肌肉的發(fā)育與功能的行使中,Tropomyosin也起著很重要的作用 (Steven et al,2003)。心肌細(xì)胞的激活狀態(tài)中, Tropomyosin起著重要的作用。在人類(lèi)條紋肌中發(fā)現(xiàn)的主要的tropomyosin 蛋 白 形 式 是 α-Tropomyosin, β-Tropomyosin和α-慢肌 Tropomyosin 。在小鼠模型中, α-形式過(guò)表達(dá)到大概整個(gè) Tropomyosin 50%的水平時(shí), 會(huì)引起心率加快和對(duì)于 Ca離子敏感度的降低 (Pieples et al, 2002)。然而，Tropomyosin的各種異構(gòu)形式在心肌以及肌肉、脊索中的具體機(jī)制仍然不清楚, 需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

為了適應(yīng)真核細(xì)胞內(nèi)與肌動(dòng)蛋白細(xì)肌絲相關(guān)的多種功能, Tropomyosin存在有大量的異構(gòu)體，其中20余種已被確認(rèn)。這些Tropomyosin異構(gòu)體分別由可變的啟動(dòng)子和 RNA序列所表達(dá), 具有共同的結(jié)構(gòu)形式。許多同源體在分布上具有組織和肌絲特異性, 意味著被表達(dá)的外顯子和其代表的分子區(qū)域?qū)ζ湎嚓P(guān)肌絲的功能具有重要意義。這些基因的突變將引發(fā)各種肌病, 因此，Tropomyosin的分子生物學(xué)研究具有重要的臨床意義。

在文昌魚(yú)中, 除了文昌魚(yú)基因組測(cè)序信息之外,目前尚無(wú)關(guān)于Tropomyosin的報(bào)道。鑒于文昌魚(yú)的特殊進(jìn)化地位, 本研究對(duì)青島文昌魚(yú)tropomyosin基因演譯的蛋白序列進(jìn)行相似性、同源性和進(jìn)化分析,并對(duì)該基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期和成體的部分組織的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步研究文昌魚(yú)體節(jié)肌肉的形成和脊索的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。通過(guò)本研究,我們可以確定文昌魚(yú)tropomyosin基因在文昌魚(yú)胚胎發(fā)育中可能的功能, 這將有助于闡明文昌魚(yú)胚胎發(fā)育的分子機(jī)制和肌肉分化的相關(guān)機(jī)制, 并對(duì)心肌的發(fā)育與功能以及進(jìn)化的研究提供資料。

1 材料和方法

1.1 文昌魚(yú)的采集及胚胎的收集

中國(guó)青島文昌魚(yú) (Branchiostoma japonicum)性成熟個(gè)體采集于青島附近沙子口海域和北海海域。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工養(yǎng)殖, 自然排精排卵并受精,胚胎置于過(guò)濾海水中, 25℃正常發(fā)育。按照不同的發(fā)育時(shí)期,取其胚胎及幼蟲(chóng), 一部分用 4%多聚甲醛(4%多聚甲醛, 用0.1 mol/L的 MOPS(pH7.5)配制, 含1 mmol/L EGTA, 0.5 mol/L NaCI)室溫固定l h或4 ℃過(guò)夜固定后, 梯度酒精脫水至70% (DEPC水配制),?20 ℃保存；另一部分離心收集后迅速加入裂解液裂解, 提取RNA備用。RNA可用于建庫(kù)或反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為基因克隆模板。

1.2 RT–PCR擴(kuò)增文昌魚(yú)tropomyosin片段

設(shè)計(jì)了擴(kuò)增文昌魚(yú)tropomyosin基因的引物。P1：5'-CGATTCCGTGATTGACTC-3'; P2：5'-TCCT TGCTCTCTCGCTCT-3'。通過(guò) RT-PCR的方法得到陽(yáng)性片段, 插入克隆質(zhì)粒, 篩選出陽(yáng)性克隆, 由華大公司對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。按照SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Laboratories, Inc.)試劑盒說(shuō)明, 基于測(cè)序所得tropomyosin序列設(shè)計(jì)引物,5'-GCAAGGAAGGTGCTGAGTAACGAGG-3', 用于擴(kuò)增該基因的3'末端, 隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將獲得的序列連入 pGEM-T-Vector(Promega)并測(cè)序, 最后用Contig軟件進(jìn)行序列拼接得到完整的3'末端, 得到tropomyosin基因的全長(zhǎng)序列。

1.3 序列相似性比較及系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)分析

以文昌魚(yú)tropomyosin基因推測(cè)的氨基酸全序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 利用在線分析工具NCBI-blastx，從NCBI的 GenBank中檢索獲得各個(gè)物種的tropomyosin同源序列, 利用Clustalx 1.8軟件對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)及序列相似性分析。用Tree-puzzle 5.2以最大似然法(Maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 并利用 TreeView (Win32)軟件顯示構(gòu)建好的進(jìn)化樹(shù)。

1.4 文昌魚(yú)胚胎和幼體的原位雜交和成體的切片原位雜交

用本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的方法標(biāo)記正義和反義探針(Liang et al, 2004)。探針長(zhǎng)度大約在700 bp～1 kb之間。選擇固定的文昌魚(yú)胚胎和幼體, 每個(gè)時(shí)期40個(gè), 未孵出的胚胎預(yù)先剝?nèi)ナ芫?。根?jù)(Zhang &Mao, 2009)所采用的辦法, 以獲得的中國(guó)文昌魚(yú)tropomyosin片段為模板合成探針, 用正義探針雜交結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。對(duì)文昌魚(yú)早期發(fā)育各時(shí)期的胚胎和幼體進(jìn)行原位雜交、常規(guī)石蠟切片, 曙紅復(fù)染,光鏡觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 文昌魚(yú)tropomyosin基因的克隆

利用設(shè)計(jì)的1對(duì)引物, 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后得到1段520 bp含有5'開(kāi)放閱讀框的序列。根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)引物, 通過(guò)3'RACE擴(kuò)增得到該基因的3'端,經(jīng)過(guò)拼接, 得到文昌魚(yú)tropomyosin的完整開(kāi)放閱讀框的cDNA核苷酸序列, 全長(zhǎng)1 210 bp。此閱讀框在 81位核苷酸處有一起始密碼子 ATG, 位于典型的kozak結(jié)構(gòu)中 (Kozak,1986), 在932位核苷酸處有一終止密碼子TAA, 編碼一個(gè)284個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。通過(guò)與ncbi的Genbank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)我們克隆得到的序列與基因組整體測(cè)序所得到的白氏文昌魚(yú)的tropomyosin基因的序列(GenBank登錄號(hào) GI:8439520) (Suzuki & Satoh,2000)相同。

2.2 文昌魚(yú)tropomyosin系統(tǒng)進(jìn)化的分析

推測(cè)得到的 Tropomyosin蛋白與其他物種的Tropomyosin蛋白之間均存在一定的同源性 (圖1)。與佛羅里達(dá)文昌魚(yú)Tropomyosin氨基酸的一致性最高為 92%; 與爪蛙 (Xenopus laevis) 和墨西哥鈍口螈 (Ambystoma mexicanum) Tropomyosin氨基酸的一致性為70%; 與旋毛形線蟲(chóng) (Trichinella spiralis)的一致性是 58%, 與其他脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú) (Danio rerio)、雞 (Gallus、gallus)、小鼠 (Mus musculus) 和人 (Homo sapiens) 氨基酸的一致性分別為 68%、68%、69%和69%。

同源蛋白比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖 1, 圖中的除白色區(qū)均是高保守區(qū), 這些區(qū)域恰好和 Tropomyosin蛋白結(jié)構(gòu)域重合, 由此可以看到 Tropomyosin蛋白在功能域的進(jìn)化上是高度保守的。從進(jìn)化樹(shù)中可見(jiàn),Tropomyosin的進(jìn)化規(guī)律符合動(dòng)物分類(lèi)學(xué)中各物種的進(jìn)化地位 (圖 2)。青島文昌魚(yú)和烏賊 (Sepia esculenta)以及旋毛形線蟲(chóng) (Trichinella spiralis) 在進(jìn)化上非常接近, 并且目前的研究表明均只有一個(gè)拷貝, 它們很可能歧化于脊椎動(dòng)物基因出現(xiàn)基因倍增之前。

2.3 文昌魚(yú)tropomyosin基因的表達(dá)模式分析

圖1 文昌魚(yú) Tropomyosin的同源性比較Fig. 1 Sequence alignment analysis of amphioxus Tropomyosin

圖2 文昌魚(yú)Tropomyosin蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of the Tropomyosin

用原位雜交(in situhybridization, ISH)的方法,檢測(cè)tropomyosin在各胚胎發(fā)育時(shí)期以及成體中的表達(dá)特異性,結(jié)果見(jiàn)圖3。在卵裂期和囊胚期均未發(fā)現(xiàn)文昌魚(yú)tropomyosin表達(dá), 在原腸胚晚期神經(jīng)胚早期開(kāi)始表達(dá), 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在于內(nèi)中胚層, 隨著早期胚胎的發(fā)育, 可以在近軸中胚層中觀察到tropomyosin較強(qiáng)的表達(dá)。從文昌魚(yú)胚胎的背面觀可以看到在身體的前后軸中線的兩側(cè)發(fā)育中的肌節(jié)和體節(jié)中有著強(qiáng)表達(dá)。由于左右體節(jié)和肌節(jié)的不對(duì)稱(chēng)(Conklin, 1932), 使表達(dá)區(qū)域從背面看起來(lái)也是不對(duì)稱(chēng)的。隨著發(fā)育的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物逐漸向后延伸,但是在已形成的肌節(jié)中仍然保持表達(dá)。從縱切面上可以看到, 肌節(jié)的著色主要位于肌節(jié)之間的分隔處。在神經(jīng)外胚層和神經(jīng)管中并未發(fā)現(xiàn)tropomyosin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)。48 h的幼蟲(chóng)中也能檢測(cè)到tropomyosin在尾芽中的表達(dá), 同時(shí)該基因也仍然在已經(jīng)形成和正在發(fā)育過(guò)程中的肌節(jié)和體節(jié)中表達(dá)。幼蟲(chóng)期的文昌魚(yú)中檢測(cè)到了tropomyosin在已形成肌節(jié)中的表達(dá)。胚胎切片顯示,tropomyosin在肌節(jié)和脊索中均有表達(dá)。成體切片原位雜交表明,tropomyosin在脊索和神經(jīng)索中仍然有表達(dá), 并且在肌肉的間隔中有微弱表達(dá), 同時(shí)我們發(fā)現(xiàn), 在腮區(qū)的腮瓣處tropomyosin有較強(qiáng)表達(dá)。

3 討 論

圖3 文昌魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期tropomyosin的整封原位雜交、切片原位雜交及其組織學(xué)切片F(xiàn)ig. 3 Tropomyosin expression in amphioxus embryos, larvae and adults detected by whole mount in situ hybridization followed by sectioning

文昌魚(yú)tropomyosin基因編碼氨基酸序列與其他物種的同源分子一致性非常高, 不論是與較低等的無(wú)脊椎動(dòng)物果蠅或者海膽, 還是與脊椎動(dòng)物比較,其一致性都在 64%以上, 即使是與人類(lèi)的tropomyosin其一致性也達(dá)到了69%。另外, 文昌魚(yú)tropomyosin序列還包含有一個(gè)Tropomyosin的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是Tropomyosin蛋白序列特有的。在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸的一致性更高。序列的一致性及其保守結(jié)構(gòu)域的存在說(shuō)明該基因的功能在進(jìn)化過(guò)程中非常保守, 承擔(dān)著比較大的進(jìn)化壓力。另外, 進(jìn)化樹(shù)顯示文昌魚(yú)Tropomyosin與其脊椎動(dòng)物同源蛋白不屬于同一姐妹群, 其分支位于脊椎動(dòng)物分支的基部, 這與文昌魚(yú)的進(jìn)化地位一致, 即文昌魚(yú)是無(wú)脊椎動(dòng)物向脊椎動(dòng)物過(guò)渡的頭索動(dòng)物類(lèi)型。同時(shí)也為文昌魚(yú)Tropomyosin歧化于脊椎動(dòng)物出現(xiàn)基因大規(guī)模倍增之前這一理論提供了新的論據(jù)。

在海鞘這樣的脊索動(dòng)物中, 脊索存在于胚胎期和可以自由游泳的幼蟲(chóng)期, 提供了運(yùn)動(dòng)所需要的軸向支持 (Satoh, 2003)。與其類(lèi)似, 在頭索動(dòng)物中脊索對(duì)于運(yùn)動(dòng)也是必須的, 而且存在于整個(gè)生命時(shí)期(Holland et al, 2004)。在脊索cDNA文庫(kù)里面的EST序列分析發(fā)現(xiàn), 有11%的mRNA是肌肉相關(guān)基因。文昌魚(yú)成體脊索里面充滿(mǎn)了肌絲來(lái)維持它的功能,而肌絲的功能是由肌肉相關(guān)基因的活化表達(dá)維持的?，F(xiàn)在的研究表明, 大概一般以上的文昌魚(yú)肌肉相關(guān)基因都在文昌魚(yú)的脊索細(xì)胞中表達(dá), 這些肌肉相關(guān)基因也都是脊椎動(dòng)物肌肉收縮的相關(guān)基因。Tropomyosin是肌肉收縮過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，其最重要的特性是能與肌動(dòng)蛋白相結(jié)合,使肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定于聚合狀態(tài),影響并調(diào)控肌動(dòng)蛋白之間的相互作用,從而在調(diào)節(jié)細(xì)胞能動(dòng)性、細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等方面起著重要作用。文昌魚(yú)Tropomyosin在發(fā)育的胚胎中集中在肌節(jié)和脊索處,胚胎時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式證實(shí)了文昌魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)期的脊索的形成以及肌節(jié)與肌肉的發(fā)生中tropomyosin起著重要的作用, 但是到了成體, 在神經(jīng)管細(xì)胞和脊索處仍然可以檢測(cè)到表達(dá)的明顯存在。這一現(xiàn)象證明文昌魚(yú)成體中Tropomyosin可能和神經(jīng)纖維的收縮有著密切的關(guān)系。Tropomyosin在細(xì)肌絲中與肌動(dòng)蛋白(actin)雙螺旋并行存在,可影響并調(diào)控肌動(dòng)球蛋白之間的相互作用, 調(diào)節(jié)肌肉收縮過(guò)程。在成體肌節(jié)中和脊索中tropomyosin的同時(shí)表達(dá), 而在肌間隔中的表達(dá)相對(duì)比較微弱, 我們推測(cè)文昌魚(yú)肌肉的收縮能力并不是很強(qiáng), 脊索和肌節(jié)可能同時(shí)參與文昌魚(yú)的個(gè)體運(yùn)動(dòng)。

我們?cè)谖牟~(yú)成體腮區(qū)的腮瓣處檢測(cè)到了tropomyosin較強(qiáng)的表達(dá), Huang(2007)對(duì)文昌魚(yú)的系統(tǒng)解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 文昌魚(yú)的腮中含有大量的淋巴樣細(xì)胞, 且這些細(xì)胞在感染后體積增大。進(jìn)一步對(duì)文昌魚(yú)進(jìn)行比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一些與淋巴細(xì)胞發(fā)育和分化密切相關(guān)的基因, 這些基因在文昌魚(yú)被感染后表達(dá)明顯上調(diào), 原位雜交結(jié)果顯示，這些基因的表達(dá)部位主要位于鰓。這說(shuō)明原始的適應(yīng)性免疫可能起源于文昌魚(yú)。同時(shí), 有證據(jù)提出在文昌魚(yú)免疫防御過(guò)程中, 其表皮、腮和腸道上皮可能起重要作用(Lin et al, 2011)。而tropomyosin在成體的腮裂處有較強(qiáng)的表達(dá), 但是在無(wú)脊椎動(dòng)物中,Tropomyosin有著一定的免疫原性, 而其在脊椎動(dòng)物中并不存在免疫原性, Tropomyosin的作用在從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中是如何演變的, 在文昌魚(yú)中 Tropomyosin是否只參與腮裂處的纖毛擺動(dòng)還是也在免疫防御過(guò)程中起作用, 仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證, 對(duì)于其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制也有待深入。

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Phylogenetic analysis and expression patterns oftropomyosinin amphioxus

LI Xin-Yi1,2,*, LIN Yu-Shuang2, ZHANG Hong-Wei2

(1.Life Science College,Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China; 2.Life Science College,Shandong University,Ji'nan250100,China)

In amphioxus, we found a mesoderm related gene,tropomyosin, which encodes a protein comprising 284 amino acid residues, sharing high identities with other known Tropomyosin proteins both in vertebrates and invertebrates.Phylogenetically, amphioxus Tropomyosin fell outside the invertebrate clade and was at the base of the vertebrate protein family clade, indicating that it may represent an independent branch. From the early neurula to the larva stage,whole-mount in situ hybridization and histological sections found transcripts of amphioxustropomyosingene. Weak tropomyosin expression was first detected in the wall of the archenteron at about 10 hours-post-fertilization neurula stage,while intense expression was revealed in the differentiating presumptive notochord and the muscle. Transcripts oftropomyosinwere then expressed in the formed notochord and somites. Gene expression seemed to continue in these developing organs throughout the neurular stages and remained till 72-hours, during the early larval stages. In situ study still showedtropomyosinwas also expressed in the neural tube, hepatic diverticulum, notochord and the spaces between myotomes in adult amphioxus. Our results indicated thattropomyosinmay play an important role in both embryonic development and adult life.

Amphioxus; Phylogenetic analysis; Embryogenesis; Expression pattern; Tropomyosin

Q959.287; Q344.13; Q951

A

0254-5853-(2012)04-0389-06

10.3724/SP.J.1141.2012.04389

2012-01-06；接受日期：2012-06-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30700434)

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: lixinyi@snnu.edu.cn