孫曉飛 廖華 楊琨 解為全

當(dāng)外周聽覺器官被噪聲等外界因素?fù)p傷后，哺乳動物的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化的同時，聽覺中樞以一種特殊的方式改變了其結(jié)構(gòu)和功能，即發(fā)生了可塑性（plasticity）的改變或重組（reorganization）［1］。聽覺中樞的可塑性一般始于耳蝸核（cochlear nucleus，CN），在下丘（inferior colliculus，IC）水平更為明顯，在聽皮層（auditory cortex，AC）最高。從腦的特異性蛋白來探討腦相關(guān)部位的突觸可塑性，是探討可塑性的一個新方向。神經(jīng)顆粒素（neurogranin，Ng）是突觸后膜的一種特異性蛋白，是腦組織中蛋白激酶C 的作用底物，主要分布在大腦皮層、海馬等區(qū)域的神經(jīng)元胞體、樹突和樹突棘［2］，目前國內(nèi)外尚沒有聲損傷后其在聽皮層表達(dá)的研究。本研究在脈沖噪聲暴露動物模型的基礎(chǔ)上［3］，采用Western－blot方法觀察脈沖噪聲暴露后不同時段大鼠聽皮層中Ng的表達(dá)，初步探討脈沖噪聲暴露對大鼠聽皮層的影響及噪聲暴露后聽皮層可塑性相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF 級健康成年SD 雄性大鼠50只，體重180～200g，隨機(jī)分成5 組，每組10只。其中4組大鼠行脈沖噪聲暴露后分為暴露后3、7、14和28天組，10只未接受噪聲暴露的大鼠設(shè)為正常對照組。

1.2 脈沖噪聲模型的建立 脈沖噪聲由電火花發(fā)生器（上海五角場儀表廠D286）產(chǎn)生。將SD 大鼠置于鐵絲籠內(nèi)，在大鼠清醒狀態(tài)下在籠內(nèi)用泡沫材料，將大鼠頭部固定在距脈沖發(fā)聲器管口水平40 cm 處。應(yīng)用聲級計（BK2209，丹麥）測量噪聲強(qiáng)度，脈沖噪聲平均壓力峰值為156dB SPL，脈寬為0.25 ms，暴露次數(shù)為50 次，每次間隔6s，每次暴露1只，暴露操作在消聲室自由場內(nèi)進(jìn)行。

1.3 主要試劑和儀器 Ng多克隆抗體、抗β－actin單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IGg抗體均購于SantaCruz公司，BCA 蛋白定量試劑盒購于谷歌生物公司，ECL 發(fā)光液購于碧云天公司，PVDF 膜購于Pall公司。

1.4 ABR 反應(yīng)閾檢測 噪聲暴露后各組動物均于噪聲暴露前、暴露后即刻和暴露后3、7、14、28天行ABR 檢測，正常對照組檢測一次。用TDT（美國TDT 公司）記錄各組動物雙側(cè)短音誘發(fā)的ABR。腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉動物（0.4 ml／100g），記錄電極置于兩耳廓前沿連線的中點(diǎn)，穿透顱骨至硬腦膜外，參考電極置于同側(cè)耳垂，地線接鼻尖中央皮下。選用短音（tone pip，頻率2～32kHz，上升、下降時間各1ms）作為刺激聲，單耳給聲刺激，強(qiáng)度范圍為20～110dB SPL，衰減間隔5dB，疊加1 024次，分析時間為10ms。以ABR 波Ⅲ剛出現(xiàn)的刺激聲強(qiáng)度定為反應(yīng)閾。

1.5 大鼠聽皮層Ng含量的表達(dá)檢測 各組動物檢測完ABR 后處死，開顱后在解剖顯微鏡下迅速分離聽皮層。每兩只大鼠兩側(cè)的聽皮層作為一個樣本，預(yù)冷三蒸水洗去血漬，液氮速凍后研磨成粉狀。取50mg聽皮層組織，加入750μl RIPA buffer，冰浴下勻漿，冰上放置30 min；并在4 ℃下，12 000 rpm 離心30 min，取上清進(jìn)行BCA 法蛋白濃度測定，測定濃度后，剩余上清分裝，－80 ℃凍存。

采用Western blot法檢測大鼠聽皮層Ng的含量，取樣本加入上樣緩沖液后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以封閉液封閉2h后加入一抗（1：800），4 ℃下?lián)u晃孵育過夜，TPBS 漂洗3 次，每次15 min；加入羊抗兔IgG 抗體（1：3 000），室溫孵育2h；TPBS漂洗3次，每次15min。將PVDF 膜上加入ECL發(fā)光液，待反應(yīng)1 min 后，放入膠片、顯影、定影。Western blot膠片經(jīng)Bio－Rad膠片掃描系統(tǒng)掃描后，用IMAGE J凝膠成像分析軟件進(jìn)行分析。蛋白表達(dá)水平以Ng光密度值與對應(yīng)內(nèi)參β－actin光密度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ABR 反應(yīng)閾 因正常對照組與噪聲暴露后各組暴露前ABR 反應(yīng)閾無明顯差異，故合并計算取均值作為正常對照組；各組噪聲暴露后即刻ABR 反應(yīng)閾也無明顯差異，故也合并計算取均值。與噪聲暴露前相比，暴露后大鼠各時間點(diǎn)各頻率ABR 反應(yīng)閾均明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中高頻閾移的幅度較低頻閾移幅度大；噪聲暴露后第7天，大鼠各頻率ABR 反應(yīng)閾有所恢復(fù)，第14天大鼠ABR 反應(yīng)閾恢復(fù)明顯，第28天大鼠ABR 反應(yīng)閾與第14 天差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但與暴露前相比，仍存在40～60dB的閾移（表1）。

表1 各組動物噪聲暴露前后各頻率ABR 反應(yīng)閾（dB SPL，±s）

表1 各組動物噪聲暴露前后各頻率ABR 反應(yīng)閾（dB SPL，±s）

注：＊與正常對照組相比，P＜0.05；△與暴露后即刻閾值相比，P＜0.05

組別2kHz 4kHz 8kHz 16kHz 32kHz正常對照組68.68±2.81 58.15±2.99 39.47±4.38 37.63±3.06 37.63±3.86暴露后即刻110.20±3.20＊108.15±2.77＊106.23±4.00＊103.22±3.11＊101.66±2.09＊暴露后3 天109.33±2.11＊105.05±4.38＊101.51±3.37＊100.22±4.08＊100.31±5.99＊暴露后7 天106.12±4.59＊101.45±9.73＊95.49±7.45＊98.28±8.23＊100.43±9.26＊暴露后14天107.27±2.58＊103.52±3.94＊93.12±5.37＊94.53±2.84＊94.51±2.84＊暴露后28 天101.30±3.94＊△96.37±3.19＊△92.59±3.54＊△90.26±4.76＊△91.73±3.16＊△

2.2 脈沖噪聲暴露前后大鼠聽皮層Ng表達(dá)的變化 正常對照組及噪聲暴露后3、7、14、28天組大鼠聽皮層Ng光密度值分別為0.68±0.08、0.96±0.05、1.11±0.05、0.78±0.04、0.36±0.03，通過Western blot檢測結(jié)果顯示：與正常對照組比較，噪聲暴露后3、7、14、28天Ng表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。可見，脈沖噪聲暴露后Ng在聽皮層的表達(dá)呈先上升后降低的過程：與對照組相比，在噪聲暴露后第3天Ng的表達(dá)明顯上升，在第7天達(dá)到峰值，隨后開始下降，第28天與第14天相比有明顯的降低，與暴露前相比，第14天Ng表達(dá)仍高于對照組，而第28天Ng表達(dá)低于對照組（圖1）。

圖1 各組大鼠聽皮層Ng的表達(dá)

3 討論

Ng分布在大腦皮層、海馬、杏仁核和紋狀體等腦區(qū)的神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘，以及線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體周圍［2，4］，是神經(jīng)元特異性的突觸后膜蛋白。正常狀態(tài)下，Ng 與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，當(dāng)神經(jīng)沖動引起N－甲基－D－天冬氨酸受體（N－methyl－ D－aspartate receptor，NMDAR）活化，導(dǎo)致NMDAR 偶聯(lián)的Ca2＋通道開放時，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，Ng與鈣結(jié)合蛋白復(fù)合體解離，細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋與鈣結(jié)合蛋白復(fù)合體濃度增加，進(jìn)而激活Ca2＋和鈣結(jié)合蛋白依賴性酶，如鈣結(jié)合蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ等的活性，這些酶大都參與長時程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）的誘導(dǎo)和維持［5，6］，而LTP 和長時程抑制（longterm depression，LTD）是突觸可塑性最經(jīng)典的機(jī)制之一，因此認(rèn)為Ng在突觸可塑性中發(fā)揮著重要的作用。Ng在突觸可塑性中的作用依賴于其在突觸后結(jié)合鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）的能力，通過調(diào)節(jié)局部CaM 的活性和控制突觸后Ca2＋／CaM 比值的變化，影響突觸的傳遞［7］。Zhong［8］的研究表明Ng 在CA1區(qū)的過表達(dá)，會增強(qiáng)突觸后的敏感性和促進(jìn)遞質(zhì)的釋放；而內(nèi)源性Ng在原位表達(dá)的停滯會阻礙LTP的誘發(fā)。Zhabotinsky［9］發(fā)現(xiàn)由突觸后顯微注射Ca2＋／CaM 可以誘發(fā)類似Ng引起的突觸活動增強(qiáng)反應(yīng)，由此可以認(rèn)為Ng誘發(fā)的突觸增強(qiáng)與CaM增多有關(guān)。而聽覺中樞的突觸可塑性在聽覺處理過程中的重要性越來越受到關(guān)注［10］。因此，本研究通過觀察噪聲暴露后不同時期聽皮層Ng 表達(dá)的變化，試圖揭示噪聲暴露后聽皮層突觸可塑性的改變。

本實驗先采用脈沖噪聲暴露建立去傳入聽覺損傷的動物模型，結(jié)果顯示，噪聲暴露后不同時期大鼠各頻率ABR 反應(yīng)閾均明顯提高，但自第7天開始，各頻率ABR 反應(yīng)閾有所恢復(fù)；而噪聲暴露后第3天Ng的表達(dá)即有一個明顯的上升過程，在第7天達(dá)到峰值，隨后開始下降，第28天與第14天相比有明顯的降低，說明噪聲暴露后Ng在大鼠聽皮層的表達(dá)呈一個先上升后降低的過程，提示脈沖噪聲刺激對大鼠聽覺系統(tǒng)產(chǎn)生了有一定持續(xù)性的顯著影響，其中聽皮層在脈沖噪聲暴露早期即出現(xiàn)突觸可塑性變化，在噪聲暴露后第7天Ng表達(dá)達(dá)到峰值，這可能是由于持續(xù)的噪聲刺激使細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的釋放增加，引起NMDAR 大量激活并與Ca2＋通道相偶聯(lián)，進(jìn)而引起Ca2＋內(nèi)流［11，12］，Ng 與CaM 的分離，使Ng的表達(dá)升高；此后聽皮層Ng表達(dá)開始下降，到噪聲暴露后28天甚至低于對照組，Ng表達(dá)顯著降低的原因，一方面可能是脈沖噪聲暴露通過各種機(jī)制導(dǎo)致了相關(guān)神經(jīng)元的死亡，進(jìn)而引起后期Ng表達(dá)的降低；另一方面，有研究顯示Ng的變化是機(jī)體調(diào)控LTP與LTD 之間平衡，并在突觸重塑期間維持神經(jīng)元功能的方式［13］。因此，Ng表達(dá)下降可能是聽皮層對于噪聲刺激的一種抑制性自我保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，本實驗通過噪聲暴露后聽皮層Ng表達(dá)的變化，提示噪聲暴露后聽皮層存在突觸可塑性改變，在進(jìn)一步研究中，將通過電生理實驗，揭示脈沖噪聲暴露后聽覺中樞Ng及突觸可塑性變化的具體機(jī)制及其病理生理意義。

1 錢敏飛，楊軍，金西銘，等.藥物性聾和噪聲性聾后聽覺中樞可塑性的研究進(jìn)展［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2004，18：63.

2 Watson JB，Battenberg EF，Wong KK，et al.Subtractive cDNA cloning of RC3，a rodent cortex－enriched mRNA encoding a novel 78residue protein［J］.J Neurosci Res，1990，26：397.

3 廖華，郜元坤，華清泉，等.脈沖噪聲暴露后大鼠頻率特異性聽性腦干反應(yīng)變化特點(diǎn)及意義［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2011，19：56.

4 Represa A，Deloulme JC，Sensenbrenner M，et al.Neurogranin：immunocytochemical localization of a brain－specific protein kinase C substrate［J］.J Neurosci，1990，10：3 782.

5 Ramakers G，Heinen K，Gispen W，et al.Long term depression in the CA1field is associated with a transient decrease in pre－and postsynaptic PKC substrate phosphorylation［J］.J Biol Chem，2000，275：28 682.

6 van Dam EJ，Ruiter B，Kamal A，et al.N－methyl－D－aspartate－induced long－term depression is associated with a decrease in postsynaptic protein kinase C substrate phosphorylation in rat hippocampal slices［J］.Neurosci Lett，2002，320：129.

7 Kubota Y，Putkey JA，Waxham MN.Neurogranin controls the spatiotemporal pattern of postsynaptic Ca2＋／CaM singnaling［J］.Biophys J，2007，93：3 848.

8 Zhong L，Cherry T，Bies CE，et al.Neurogranin enhances synaptic strength though its interaction with calmodulin［J］.EMBO J，2009，28：3 027.

9 Zhabotinsky AM，Camp RN，Epstein IR，et al.Role of the neurogranin concentrated in the induction of long－term potentiation［J］.J Neurosci，2006，26：7 337.

10 Bender KJ，Trussell LO.Synaptic plasticity in inhibitory neurons of the auditory brainstem［J］.Neuropharmacology，2011，60：774.

11 Chertoff ME，Yi X，Lichtenhan JT.Influence of hearing sensitivity on mechano－electric transduction［J］.J Acoust Soc Am，2003，114（6Pt 1）：3 251.

12 Ehrenberger K，F(xiàn)elix D.Glutamate receptors in afferent cochlear neurotransmission in guinea pigs［J］.Hear Res，1991，52：73.

13 Zhong L，Gerges NZ.Neurogranin and synaptic plasticity balance［J］.Commun Integr Biol，2010，3：340.