賀克，劉姣，李彩霞，劉麗華，李清

1.石家莊市第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北石家莊 050011；2. 河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，河北石家莊 050091

子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)為育齡婦女的常見(jiàn)疾病，是指子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)異位并種植、生長(zhǎng)于子宮腔體以外部位[1]。盆腔疼痛為EMS主要臨床癥狀之一，給女性帶來(lái)了極大痛苦，嚴(yán)重影響了女性的身心健康。近年來(lái)，因其發(fā)病率逐年上升而受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，但其發(fā)病機(jī)理至今不明。丹莪婦康煎膏具有活血化瘀，疏肝理氣，調(diào)經(jīng)止痛，軟堅(jiān)化積功效，為臨床治療EMS的常用中成藥，對(duì)EMS患者出現(xiàn)的經(jīng)期不適、痛經(jīng)等癥狀具有較好療效。為觀(guān)察丹莪婦康煎膏對(duì)EMS的防治作用以及其抑制EMS盆腔疼痛的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用子宮內(nèi)膜自體移植法建立大鼠EMS模型，通過(guò)觀(guān)察異位子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)改變，血漿血栓烷B2、6-酮-前列腺素F1α的含量變化，以期為臨床應(yīng)用提供參考及依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠，清潔級(jí)，雌性，體重180～200g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證 SYXK(冀)2006-0047，動(dòng)物合格證號(hào)1009075。飼養(yǎng)于溫度20～23℃，濕度45～60%，過(guò)氧乙酸溶液消毒環(huán)境。

1.2 藥物 丹莪婦康煎膏，昆明滇虹藥業(yè)有限公司，批號(hào)100404；孕三烯酮，北京紫竹藥業(yè)，批號(hào)53110101；慶大霉素，石家莊制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)068100905；苯甲酸雌二醇，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)009004。

1.3 試劑 血栓烷B2放射免疫分析藥盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司；6-酮-前列腺素F1α放射免疫分析藥盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。

1.4 儀器 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；5417R型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；756MC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)γ放免分析儀，北京金泉水科技有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物 造模采用自體移植法建立EMS大鼠模型， 造模前2天，大鼠每日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1mg/kg體重促情，假手術(shù)組肌肉注射等容量生理鹽水。手術(shù)時(shí)，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.2mL/100g體重，待麻醉后固定于操作板上。開(kāi)腹找到子宮，暴露左側(cè)子宮，在離卵巢約1cm處，分離附著于子宮肌壁的脂肪和結(jié)締組織，兩端分別用手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎，剪取中間約1cm長(zhǎng)子宮組織，縱向剖開(kāi)宮腔，暴露子宮內(nèi)膜，切取5mm×5mm的子宮壁塊[1]。在腹壁切口右側(cè)的腹肌與皮下筋膜層之間打隧道，以正好能置入子宮壁塊為宜，將子宮壁塊平整的置入右側(cè)隧道底部，使內(nèi)膜面緊貼腹肌，常規(guī)關(guān)閉腹腔[2]。假手術(shù)組按上述方法切取子宮組織，丟棄，關(guān)腹，其余操作同上。術(shù)后各鼠腹腔注射慶大霉素0.4萬(wàn)U/只，連續(xù)5d。術(shù)后次日，各鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1mg/kg體重，每隔4d1次，共3次，以促進(jìn)移植內(nèi)膜的生長(zhǎng)[3]，假手術(shù)組肌肉注射等容量生理鹽水。術(shù)后每周觸摸包塊2次，觀(guān)察是否出現(xiàn)包塊及包塊的體積變化。術(shù)后第21d，將大鼠麻醉后固定，開(kāi)腹，觀(guān)察異位內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。以游標(biāo)卡尺測(cè)量異位內(nèi)膜組織體積，若體積增大≥8mm3，并出現(xiàn)液體積聚，隆起呈透明小囊狀，則為造模成功。

2.2 分組與處理 取造模成功的大鼠40只，隨機(jī)分為模型組(MG)，丹莪婦康煎膏高劑量組(DFD-H，6g/kg·d)、低劑量組(DFD-L，3g/kg·d)、孕三烯酮組(GSG，0.5mg/kg·d)，每組10只。另設(shè)假手術(shù)組(SHM)大鼠10只。各組大鼠每日灌胃給藥(或蒸餾水)一次，給藥容量為10mL/kg體重，連續(xù)30d。末次給藥后禁食12h，麻醉，開(kāi)腹，腹主動(dòng)脈取血。觀(guān)察異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，以游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)、寬、高，并快速剪取異位子宮內(nèi)膜，以10%甲醛液固定。

2.3指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 取異位子宮內(nèi)膜組織，常規(guī)石蠟包埋，作4μm連續(xù)切片，HE染色，觀(guān)察子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用放免法測(cè)定血漿血栓烷，B2(TXB2) 6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PG1α)含量。

圖 1 各組大鼠異位病灶體積比較Fig 1 The ectopic lesion volume of rats in each group

3 結(jié)果

3.1 異位病灶的外觀(guān) 觀(guān)察EMS模型大鼠腹腔內(nèi)有廣泛粘連，可見(jiàn)移植物體積顯著增大，呈近圓形，囊狀，表面有血管生長(zhǎng)，內(nèi)有淡黃色透明積液。經(jīng)藥物治療后，腹腔內(nèi)粘連減少，移植物體積顯著縮小且部分萎縮，囊內(nèi)液體較少或基本消失。各組異位病灶體積比較見(jiàn)圖1。 與模型組相比：**P<0.01。

3.2 異位病灶的形態(tài)學(xué) 觀(guān)察對(duì)異位病灶進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察可見(jiàn)：模型組大鼠橫紋肌旁可見(jiàn)子宮內(nèi)膜組織，腺腔體積較大，腺上皮呈單層柱狀，間質(zhì)致密，見(jiàn)圖2。以孕三烯酮治療后，異位腺體幾乎不可見(jiàn)，見(jiàn)圖3。以丹莪婦康煎膏治療后，異位腺腔體積明顯減小，并有部分細(xì)胞呈萎縮狀，腺腔內(nèi)有粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖4、5。

3.3 丹莪婦康煎膏 對(duì)血漿血栓烷B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量的影響從表1結(jié)果可見(jiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿TXB2含量顯著升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P<0.01)，TXB2與6-Keto-PGF1α比值顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，丹莪婦康煎膏各劑量組大鼠血漿TXB2含量顯著降低(P<0.01)；丹莪婦康煎膏高劑量組大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量明顯升高(P<0.05)，低劑量組也有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各劑量丹莪婦康煎膏均能使大鼠血漿TXB2與6-Keto-PGF1α比值較模型組顯著降低(P<0.01)。

圖 3 孕三烯酮組異位病灶組織學(xué)觀(guān)察(HE×100)Fig 3 The ectopic lesions histologic observation of the gestrinone group (HE × 100)

圖 4 低劑量組異位病灶組織學(xué)觀(guān)察(HE×100) Fig 4 The ectopic lesions histologic observation of the low-dose group (HE × 100)

圖 5 高劑量組異位病灶組織學(xué)觀(guān)察(HE×100)Fig 5 The ectopic lesions histologic observation of the high-dose group (HE × 100)

表 1 丹莪婦康煎膏對(duì)EMS大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量的影響(n=10, ±s)Tab 1 The influence of DFD on the EMS rats' plasma 6-Keto-PGF1α(n=10, ±s)

表 1 丹莪婦康煎膏對(duì)EMS大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量的影響(n=10, ±s)Tab 1 The influence of DFD on the EMS rats' plasma 6-Keto-PGF1α(n=10, ±s)

組 別TXB2(ng/mL)TXB2/6-Keto-PGF1α SHM 3.79±0.60**836.19±452.29**5.52±2.66**MG5.88±0.67 364.49±74.42 16.88±4.36 GSG 5.14±0.62* 846.20±434.27**6.80±1.85**DFD-H 4.80±0.51**687.31±248.51* 7.79±2.64**DFD-L 4.86±0.67**648.84±208.55 4.81±2.33**6-Keto-PGF1α(pg/mL)

4 討論

子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)是育齡婦女常見(jiàn)疾病之一，雖為良性疾病，但其引起的痛經(jīng)、性交痛、不孕等對(duì)女性的生活和健康卻帶來(lái)了極大的影響。目前臨床上尚無(wú)治愈EMS的藥物，只能緩解癥狀或控制疼痛。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療EMS因其療效好，不良反應(yīng)低，易為患者接受，受到了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為，EMS屬于痛經(jīng)、癥瘕、不育等范疇，與血瘀有關(guān)。由于血瘀而致氣血運(yùn)行不暢，“不通則痛”；或胞宮失于濡養(yǎng)，“不榮則通”，而出現(xiàn)痛經(jīng)，臨床常以行氣活血，化瘀止痛藥進(jìn)行治療[4]。丹莪婦康煎膏，由紫丹參、莪術(shù)、竹葉柴胡、三七、赤芍、當(dāng)歸、三棱、香附、延胡索、甘草組成，具有活血化瘀、疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛、軟堅(jiān)化積功效，對(duì)婦女瘀血阻滯所致月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)期不適、盆腔子宮內(nèi)膜異位癥見(jiàn)上述癥狀者均具有較好療效。為探究丹莪婦康煎膏緩解EMS盆腔疼痛的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察異位子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)改變，血漿血栓烷B2、6-酮-前列腺素F1α的含量變化，以期為臨床應(yīng)用提供參考及依據(jù)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，E M S痛經(jīng)患者血漿血栓烷A2(TXA2)含量顯著升高，前列環(huán)素(PGI2)含量顯著降低[5]。TXA2為血小板微粒體合成的血管收縮劑，能夠使血小板內(nèi)cAMP減少，并引起Ca2+內(nèi)流，造成血小板聚集性增強(qiáng)。而前列環(huán)素(PGI2)則是一種抑制血小板聚集的物質(zhì)，并具有擴(kuò)張血管的作用。正常情況下，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)TXA2及PGI2含量保持平衡，調(diào)控血管舒縮、血小板聚集[6-8]。而臨床研究發(fā)現(xiàn)，EMS患者的TXA2、PGI2比值較正常人升高，造成血管收縮，血小板聚集性高，進(jìn)而子宮平滑肌血流減少，出現(xiàn)痙攣性收縮，引起盆腔疼痛。由于TXA2及PGI2均不穩(wěn)定，極易代謝為T(mén)XB2、6-Keto-PGF1α，因此本研究對(duì)EMS大鼠血漿TXB2、6-Keto-PGF1α含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿TXB2含量顯著升高，6-Keto-PGF1α含量顯著降低，二者比值顯著升高，與臨床報(bào)道吻合。

應(yīng)用丹莪婦康煎膏進(jìn)行治療后，可見(jiàn)EMS大鼠腹腔內(nèi)粘連減少，移植物體積顯著減小；病理切片可見(jiàn)異位腺腔體積減小，并有部分細(xì)胞萎縮。消除異位病灶是丹莪婦康煎膏治療EMS盆腔疼痛的根本原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，丹莪婦康煎膏能夠通過(guò)顯著降低血漿TXB2含量，明顯升高6-Keto-PGF1α含量，顯著降低TXB2與6-Keto-PGF1α比值，從而改善子宮平滑肌血管，緩解痙攣，減少盆腔疼痛。

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