林葉新，李忠海

（1．中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙410004；2．重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶400030）

林檎葉防腐保鮮成分微波提取工藝的優(yōu)化研究

林葉新1，2，李忠海1

（1．中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙410004；2．重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶400030）

在林檎葉天然防腐保鮮成分微波輔助浸提工藝中通過均勻試驗設(shè)計構(gòu)建模型，運用Excel中回歸分析工具得到回歸方程。試驗中所選因素對微波輔助提取的影響順序為：微波功率＞液料比＞浸提次數(shù)＞微波時間。確定林檎葉防腐保鮮成分提取最優(yōu)工藝條件為：微波時間1min，微波功率700W，液料比61．62∶1，浸提次數(shù)3．51。對林檎葉防腐保鮮成分中的活性成分進行化學(xué)定性分析，其中含有黃酮類化合物、多元酚類及皂甙等活性物質(zhì)。

林檎葉；防腐保鮮成分；微波輔助提取法；均勻?qū)嶒炘O(shè)計

我國林檎（Malus Mellina）分布廣泛，資源豐富，但目前利用率不高，主要作為民間茶飲。已有研究報道，林檎葉提取物對食品防腐有一定效果，對一些細(xì)菌、霉菌和酵母有抑制作用［1～2］；同時，林檎茶葉中含有多種維生素，多酚類含量占5%左右，黃酮類物質(zhì)一般茶葉僅占多酚總量的1%～2%，林檎茶中占60%以上［3］；而多酚類物質(zhì)及黃酮類化合物中的類黃酮具有抗氧化和抑菌作用，其中黃酮抗油脂過氧化的作用早已經(jīng)被證實，這為更好地利用林檎葉資源，開發(fā)新型天然防腐保鮮劑提供了理論依據(jù)。本試驗以林檎葉為原料，采用微波輔助浸提法提取林檎葉中的防腐保鮮活性成分。通過均勻?qū)嶒炘O(shè)計得到微波輔助浸提工藝各因素的回歸方程，確定微波輔助浸提的最優(yōu)工藝，并對林檎葉提取物成分進行了初步鑒定，為進一步研究林檎葉在防腐保鮮方面的開發(fā)利用，提供一定的理論基礎(chǔ)和工藝指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

尖嘴林檎鮮葉。

三氯化鐵（AR）、六氰合鐵酸鉀（AR）、醋酐（AR）、醋酸（AR）、95%乙醇（AR）、硝酸鋁（AR）、甲醇（AR）、鹽酸（AR）、鎂粉（AR）、DPPH（95%，Lot No：K17Q036）、Tris Base（BR）、乙 醇 （AR）、鹽 酸（AR）、鄰苯三酚（AR）、硫酸亞鐵（AR）、過氧化氫（30%AR）、水楊酸（AR）。

1．2 主要試驗儀器

LGJ-10真空冷凍干燥機，R201D-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，WD700G型微波爐，UV-1700紫外分光光度計，UV-PROBE操作系統(tǒng)。

1．3 林檎葉防腐保鮮成分提取工藝試驗方法

1．3．1 林檎葉防腐保鮮成分提取工藝流程

尖嘴林檎葉→40℃熱風(fēng)干燥→粉碎過0.025mm篩→加入溶劑→微波提取→水浴浸提→濃縮、冷凍干燥→取樣檢測。

1．3．2 林檎葉防腐保鮮成分得率的計算公式

1．3．3 林檎葉防腐保鮮成分提取工藝條件的選擇

稱取林檎葉粉3份，每份3g，置于三角瓶中，按液料比（溶劑∶干粉重量，W／V）為30∶1按以下步驟加入溶劑提取。各水平試驗5次取平均值。

（a）提取溶劑的選擇：林檎葉粉分別加入蒸餾水，60%酒精，95%酒精，放入微波爐中，在功率為350W條件下提取2min后，于40℃的水浴中浸提30 min。濃縮提取液，冷凍干燥，稱重。

（b）水浴浸提溫度的選擇：林檎葉粉加入蒸餾水，放入微波爐中，在功率為350W條件下提取2 min后，分別置于30℃、40℃和50℃的水浴中浸提1h。濃縮提取液，冷凍干燥，稱重。

（c）水浴浸提時間的選擇：林檎葉粉加入蒸餾水，放入微波爐中，在功率為350W條件下提取2 min后，分別置于40℃的水浴中浸提30min、1h和2h。濃縮提取液，冷凍干燥，稱重。

1．3．4 林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提工藝條件的優(yōu)化

（a）林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提方法

稱取9月林檎葉粉3g，置于三角瓶中，按試驗因素表，加入通過前期試驗選出的提取溶劑，并設(shè)定好萃取條件，用間歇式處理的方式進行微波輔助提取。微波提取后，置于水浴中，并按前期試驗確定的水浴浸提時間和溫度進行浸提。濃縮提取液，冷凍干燥，測定提取率，各水平試驗5次取平均值。

林檎葉防腐保鮮成分微波輔助萃取效率受到多種因素的影響，本試驗中選擇微波時間、微波功率、液料比、浸提次數(shù)作為試驗因素。由于微波爐的輸出功率為700W，輸出功率只能調(diào)節(jié)5個水平，即10%、30%、50%、80%和100%，所以輸出功率為：70W、210W、350W、560W和700W。各個因素水平及試驗安排見表1。

表1 試驗設(shè)計方案因素水平表Table 1 Table of factors level of design plan

1．3．6 林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提與其他提取方法比較試驗

（a）林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提與水浴浸提法比較試驗

稱取9月林檎葉粉3g，置于三角瓶中，在料液比、浸提次數(shù)、浸提溫度與最優(yōu)微波輔助浸提條件相同的情況下，水浴浸提6h，與微波輔助浸提法進行比較，水平試驗5次。

（b）林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提與回流法比較試驗

稱取9月林檎葉粉3g，置于三角瓶中，在料液比、浸提次數(shù)與最優(yōu)微波輔助浸提條件相同的情況下，回流提取6h，比較回流法與微波輔助浸提法效果，水平試驗5次。

1．4 林檎葉提取物成分初步分析方法[4]

(1) 大雙邊供電模式下單列AW3車測試場景如圖3所示。通過該場景可以測得單列AW3車完整的起動電流波形?？梢耘c單邊供電模式下單列AW3車測試數(shù)據(jù)進行對比分析?？蔀閱蝹€牽引變電站解列情況下的供電運行負(fù)載需求提供依據(jù)?？蓪€路中間點電壓能否滿足線路上列車運行最低電壓需求進行驗證。

1．4．1 黃酮類化合物組成的鑒定

（a）三氯化鋁試驗：取樣品的乙醇溶液點于濾紙片上（干后再點1次，使其濃度庥中），干后，噴霧1%三氯化鋁乙醇試液，在紫外光燈下觀察，呈現(xiàn)黃色、綠色、橙色等熒光為黃酮類。

（b）鹽酸-鎂粉試驗：取樣品的乙醇溶液1mL，加放少量鎂粉，然后加濃鹽酸4～5滴，置沸水浴中加熱2～3min，如出現(xiàn)紅色、淡黃色、橙色、紫色或藍(lán)色表示有游離黃酮類或黃酮甙。

1．4．2 酚類的鑒定

（a）三氯化鐵試驗（鞣質(zhì)及酚類）：取樣品的水溶液1 mL，加三氯化鐵試液1～2滴，若有水解鞣質(zhì)呈現(xiàn)出藍(lán)-藍(lán)黑色，若有縮合鞣呈現(xiàn)出綠色-污綠色。

（b）香草醛-酸試驗：取樣品的水溶液點于濾紙片上，干后，噴霧或滴加香草醛-鹽酸試液，如呈現(xiàn)紅色斑點，表明含有多元酚類物質(zhì)。

1．4．3 甾醇、甾體皂甙及三萜類化合物的鑒定

（a）泡沫試驗：取樣品的水溶液2mL于帶塞試管中，用力振搖3min，若產(chǎn)生持久性蜂窩狀泡沫（維持10min以上），且泡沫量不少于液體體積的1／3，表明含有甾醇、甾體皂甙及三萜類化合物。

（b）醋酐濃硫酸試驗（Liebrmann Burchard反應(yīng)）：取樣品的水溶液置蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸干，殘渣加入少量冰醋酸使溶解，再加入醋酐濃硫酸（19∶1）試液，呈現(xiàn)紅紫色并變成污綠色，表明含有甾醇、甾體皂甙及三萜類化合物。

2 結(jié)果與討論

2．1 提取溶劑的選擇

提取溶劑分別為蒸餾水、60%食用酒精及95%食用酒精時，林檎葉防腐保鮮成分的提取率分別為15．43%、15．54%、15．36%，提取溶劑為60%食用酒精時的提取率最高，但相差不大?？紤]到天然防腐保鮮成分的安全性以及提取成本，提取工藝試驗的研究將采用蒸餾水作為提取溶劑。

2．2 水浴浸提溫度的選擇

據(jù)有關(guān)研究報道，直接用溫水浸泡得到的林檎葉提取液比用沸水浴提取1h得到的有更好的抗菌效果［2］。所以，本試驗選取的浸提溫度為30℃、40℃和50℃， 提取率分別為15．19%、16．39%、18．37%。表明隨著提取溫度的增高，林檎葉的提取率也增高。浸提溫度為50℃時，提取率明顯高于40℃的提取率，因此選用50℃作為浸提溫度。

2．3 水浴浸提時間的選擇

浸提時間為30min、60min和120min的提取率分別為15．43%、16．39%、16．47%。隨著浸提時間的增加，提取率逐漸增大。但是浸提時間60min和120min的得率相當(dāng)，為節(jié)約時間，按60min進行浸提。

2．4 林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提工藝均勻試驗結(jié)果

參照文獻［5］的方法選用U10*0均勻設(shè)計表進行擬水平設(shè)計產(chǎn)生4因素的U10（10×53）表，得到試驗設(shè)計方案如表2。根據(jù)以上分析，將蒸餾水作為提取溶劑，每次處理后的樣品置于50℃水浴中浸提60min，再進行濃縮和冷凍干燥，最后計算每個試驗林檎葉提取物的平均得率（表2）。為了對均勻試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，確定最佳浸提工藝條件，根據(jù)胡亮等［6］提出的數(shù)據(jù)處理方法進行計算。需要計算出各因素水平的平方，也見表2。

表2 提取林檎葉防腐保鮮成分的均勻?qū)嶒灧桨浮⒃囼灲Y(jié)果及各因素水平的平方Table 2 Uniform design of the extraction of the antiseptic compositions from the menus Doumeri Leaf and its results，and the square of factors level

然后運用Excel中“回歸”分析工具，以產(chǎn)品得率為因變量，各因素水平及各因素水平的平方為自變量，進行回歸分析，第一次回歸分析得到的 回 歸 方 程 如 下 ：Y＝0．05546－0．0372X1＋0．000062X2＋0．00504X3＋0．07422X4＋0．00466X12－0．00000002X22－0．00004X32－0．0107X42。 回歸統(tǒng)計結(jié)果表明，該方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0．9959很接近于1。 方 差 分 析 結(jié) 果 表 明 ，F(xiàn)＝30．353， 遠(yuǎn) 大 于Significance F值（0．1395），表明回歸方程已非常顯著。由于自變量數(shù)目不多，采取向后逐步消去法逐個剔除不顯著因素。從該方程可看出，X22的回歸系數(shù)最小?；貧w分析結(jié)果也表明X2最不顯著。故剔除X2項后再次進行回歸分析。

剔除X22后得到的回歸方程如下：Y＝0．069096－0．034319X1＋0．000045X2＋0．004729X3＋0．068109X4＋0．004138X12－0．0000384X32－0．009692X42?；貧w統(tǒng)計結(jié)果表明，該方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0．9977， 同樣很接近于1。F值由30．35增加到62．77，同樣遠(yuǎn)大于Significance F，回歸方程仍非常顯著。標(biāo)準(zhǔn)誤差由0．00587降到0．00436，使最佳響應(yīng)值穩(wěn)定性提高了。此時回歸分析結(jié)果表明X12最不顯著。但如剔除該欄后再次進行回歸分析，則顯著性降低，標(biāo)準(zhǔn)誤差增大。故不繼續(xù)進行剔除，保留上述結(jié)果作進一步分析。

由第二次回歸分析數(shù)據(jù)的“t Stat”及“P-value”值可知， 因素顯著性主次順序為：X2＞X3＞X4＞X42＞X32＞X1＞X12。因此推斷出，林檎葉防腐保鮮成分提取工藝各因素對試驗結(jié)果的影響順序為：微波功率＞液料比＞浸提次數(shù)＞微波時間。

運用Excel中“規(guī)劃求解”工具，以確定最佳浸提工藝條件。 得到尋優(yōu)結(jié)果為：X1＝1，X2＝700，X3＝61．62，X4＝3．51，即最佳試驗條件是：微波時間1min，微波功率700W，液料比61．62∶1，浸提次數(shù)3．51。此時的產(chǎn)品得率為34．94%。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)誤差s＝0．00436，可得最佳產(chǎn)品得率的變動范圍為34．94%±0．44%。

2．5 林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提最優(yōu)工藝驗證試驗結(jié)果

為更好地驗證最優(yōu)工藝條件，以微波時間1 min，微波功率700W，液料比60∶1，浸提次數(shù)4次為提取條件（后兩個試驗條件取整值），進行林檎葉防腐保鮮成分提取最優(yōu)工藝的驗證試驗，并與理論的最佳產(chǎn)品得率相比較，結(jié)果驗證值為35．16%±0．11%。林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提理論得率為34．94%±0．44%，與驗證試驗結(jié)果一致，且在變動范圍內(nèi)。由此說明試驗中所設(shè)模型與實際情況相符，回歸模型可靠性高。同時，驗證實驗中的RSD＝0．11%（n＝5），說明重現(xiàn)性好。

2．6 林檎葉防腐保鮮成分微波輔助浸提與其他提取方法比較試驗

試驗表明，直接利用50℃水浴浸提6h，得率為16．32%，而利用回流法提取6h，得率為23．41%，而用微波輔助浸提法，得率為35．162%?？梢娢⒉ㄝo助浸提法提取林檎葉防腐保鮮成分得率高于水浴浸提法和回流法，證明微波輔助浸提法更為高效、省時。

微波提取方法的優(yōu)點是提取率高、準(zhǔn)確、快速、操作成本低，減少原料預(yù)處理費用，并對環(huán)境無害。利用微波提取，能使物料受熱快且均勻，并直達物料的內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng)，使細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的有效成分迅速從細(xì)胞壁周圍流出，在較低的溫度下被萃取溶劑溶解；同時，微波所產(chǎn)生的電磁場加速活性物質(zhì)由物料內(nèi)部向萃取溶劑界面的擴散速率，從而提高萃取速率，故利用微波萃取法不但速度快，效率高，更能保持目標(biāo)產(chǎn)物的生理活性。因此本試驗將微波輔助浸提法應(yīng)用于林檎葉天然防腐保鮮劑的提取工藝中，更好地提高了林檎葉天然防腐保鮮成分提取率，縮短了提取時間，并保留了更多活性物質(zhì)。

本試驗主要采用均勻試驗設(shè)計對林檎葉天然防腐保鮮成分提取工藝進行優(yōu)化，是在林檎葉相關(guān)研究報道中未曾運用過的實驗設(shè)計方法。均勻?qū)嶒炘O(shè)計可以減少試驗次數(shù)；同時，均勻設(shè)計是沿用回歸設(shè)計的思想，對模型沒有要求很強的假定，對模型的變化有一定的穩(wěn)健性；是所有試驗設(shè)計中一個因素能安排水平數(shù)最多的試驗設(shè)計［6］。本研究對此試驗方法的運用可為均勻試驗設(shè)計在食品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

2．6 林檎葉提取物的初步鑒定

2．6．1 黃酮類化合物組成的鑒定

三氯化鋁試驗：在紫外光燈下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光，表明提取物分中含有為黃酮類。鹽酸-鎂（或鋅）粉試驗：出現(xiàn)紅色，表示提取物中有游離黃酮類或黃酮甙。

2．6．2 酚類的鑒定

三氯化鐵試驗（鞣質(zhì)及酚類）：出現(xiàn)綠污綠色，說明提取物中含有縮合鞣質(zhì)。香草醛-酸試驗：呈現(xiàn)紅色斑點，表明提取物中含有多元酚類物質(zhì)。

2．6．3 甾醇、甾體皂甙及三萜類化合物的鑒定

泡沫試驗：產(chǎn)生持久性蜂窩狀泡沫，且維持10min以上，泡沫量多于液體體積的1／3，表明提取物中含有皂甙。醋酐濃硫酸試驗：呈現(xiàn)紅紫色并變成污色綠色，表明提取物中含有甾類、三萜類成分或皂甙。

3 結(jié)論

通過均勻?qū)嶒炘O(shè)計，系統(tǒng)地研究了林檎葉防腐保鮮成分的提取工藝，得到如下結(jié)論：

（1）通過對林檎葉防腐保鮮成分提取工藝條件的選擇，選擇蒸餾水作為提取溶劑，水浴浸提條件為：50℃水浴，浸提60min。

（2）利用均勻?qū)嶒炘O(shè)計對林檎葉防腐保鮮成分提取工藝進行優(yōu)化，運用Excel中“回歸”分析工具，得到回歸方程：Y＝0．069096－0．03432X1＋0．0000446X2＋0．004729X3＋0．06811X4＋0．004138X12－0．0000384X32－0．00969X42。 在試驗范圍內(nèi)，4個提取因素對提取率的影響順序為：微波功率＞液料比＞浸提次數(shù)＞微波時間。

（3）通過對均勻設(shè)計試驗數(shù)據(jù)處理結(jié)果進行“規(guī)劃求解”，得到最優(yōu)提取工藝為：微波時間1min，微波功率700W，液料比61．62∶1，浸提次數(shù)3．51。驗證試驗表明，在此條件下提取，林檎葉防腐保 鮮 成 分 得 率為35．16%±0．112%與理論 值34．94%±0．44%基本一致，驗證試驗的RSD＝0．32%（n＝5），重現(xiàn)性好。由此說明試驗中所設(shè)模型與實際情況相符，回歸模型可信度高。

（4）初步定性鑒定表明，林檎葉提取物含有黃酮類化合物、縮合鞣質(zhì)、多元酚類、甾醇、甾體皂甙及三萜類化合物，具有防腐保鮮方面的應(yīng)用開發(fā)價值，有關(guān)方面研究將另文報道。

［1］ 鄧芳席，黃祖法．林檎葉抑菌作用的研究［J］．食品科學(xué)，1996，17（3）：47-50．

［2］ 黃衛(wèi)文，鐘海雁，魏元青。林檎葉中有效成分在小白鼠體內(nèi)的抑菌作用 ［J］．中南林學(xué)院學(xué)報，2001，21（3）：54-57．

［3］ 鄧毓芳，鐘海雁，李忠海，等．林檎葉保健茶的研制［J］．湖南食品發(fā)酵，1992，（1）：22-25．

［4］ 丁林生，孟正木．中藥化學(xué)［M］．南京：東南大學(xué)出版社，2005．

［5］ 王欽德，楊堅．食品試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003．

［6］ 胡亮，楊大錦．Excel與化學(xué)化工試驗數(shù)據(jù)處理［M］，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004．

Study on Optimization of Antiseptic Compositions Which Come From Malus Mellina Leaves by Microwave Extraction Technology

LIN Ye-xin1，2，LI Zhong-hai1，
（1．College of Food Science＆Engineering，Central South University of Forestry＆Technology，Changsha 410004，China；2．College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400030，China）

In order to maximize the distill ratio of the antiseptic compositions from Malus Mellina leaves，the uniform design composing model was used to optimize the technology of microwave-assisted extraction，and the regression equation of extraction process was determined by the regression analysis tool from the Microsoft Excel form．All the tested factors affected the yield significantly in the microwave-assisted extraction，with the order as microwave power rate＞ratio of solvents and material＞extracting times＞microwave time．The optimal process conditions for microwave extraction were as followed：microwave time at 1 min，microwave power at 700W，ratio of solvents to material was 61．62∶1，extracting times was 3．51，and the production achievement rate was 34．94%at this moment．The proved active ingredients of the Malus Mellina leaves were flavone，polyphenolic，saponin and etc．by chemical qualitative analysis．

Malus Mellina leaves；antiseptic composition；microwave-assisted extraction；uniform experimental design

TS 205

A

1671-9905（2012）03-0013-05

林葉新（1984-），女，現(xiàn)于重慶大學(xué)攻讀博士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)及功能評價，Email：starelin＠163．com

2011-12-08