李良昌 延光海 李光昭 沈光海 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研部，吉林 延吉 33000)

肥大細(xì)胞膜表面表達(dá)IgE高親和力受體，經(jīng)活化后可產(chǎn)生和釋放多種炎性介質(zhì)，從而引起多種變態(tài)反應(yīng)癥狀。炎癥反應(yīng)與肥大細(xì)胞脫顆粒密切相關(guān)，也是過敏反應(yīng)過程中的關(guān)鍵步驟，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺可減輕炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度〔1〕。黃梅木(別名檀香梅)在中國的遼寧、山西、陜西、甘肅、山東、江蘇、安徽、江西、湖北、四川等省亦廣泛分布，名為三鉆風(fēng)、甘姜、香麗水等，以樹皮人藥，主治跌打損傷、瘀血腫痛;外用鮮樹皮搗爛敷患處〔2〕。本實(shí)驗(yàn)探討黃梅木提取物對(duì)肥大細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重為200～250 g的健康成熟SD雄性大鼠(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證:10-1022)。室溫(22±1)℃、相對(duì)濕度50% ～60%、光照周期12/12 h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 Anti-DNP IgE、DNP人血清蛋白(HSA)、MTT、組胺檢測(cè)試劑盒、同位素Ca2+、氮卓斯汀、抗actin抗體以及HEPES均購自美國 Sigma公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、抗核轉(zhuǎn)移因子(NF-κB)p65多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(RT-2100C，美國)，CO2培養(yǎng)箱(TC23232E，美國)，電泳儀及電泳槽(E-C Apparatus Corporation，美國)，Western印跡轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司)，核酸/蛋白質(zhì)含量測(cè)定儀(SmartSpec Plus)，高速冷凍離心機(jī)(TGL-16G)，RF-540型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.4 方法

1.4.1 黃梅木提取物制備方法 取干燥的黃梅木樹枝1 000 g(延邊大學(xué)藥學(xué)院提供)加3 500 ml 70%乙醇，用加熱萃取機(jī)萃取4 h，將取得的萃取液用濾紙濾過，然后使用回轉(zhuǎn)真空濃縮機(jī)，上清液在45℃減壓濃縮，經(jīng)冷凍干燥得粉末80 g，臨用前以蒸餾水或生理鹽水配制。

1.4.2 腹腔肥大細(xì)胞的獲取 腹腔肥大細(xì)胞的分離提純是采用 Choi等〔3〕的方法。

1.4.3 被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)(PCA)實(shí)驗(yàn)〔4〕將健康SD大鼠隨機(jī)分為6組:包括正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，黃梅木提取物低、中、高劑量組(100、200、400 mg/ml)及陽性藥物對(duì)照組(氮卓斯汀，10 mg/ml)，每組10只大鼠。大鼠背部皮內(nèi)注射200 ng anti-DNP IgE，24 h后大鼠陰部靜脈注射含有100 μg DNP HSA的1%伊文思藍(lán)混合液200 μl。注射伊文思藍(lán)前24、12、1 h黃梅木提取物高、中、低劑量灌胃治療。30 min后，切開背部皮膚藍(lán)色斑點(diǎn)部位，稱量，細(xì)切放入HERES-Tyrode溶液在60℃干燥機(jī)水浴箱上放置3 h。用分光光度計(jì)在620 nm下測(cè)定滲出的伊文思藍(lán)濃度。

1.4.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 利用MTT進(jìn)行檢測(cè)黃梅木提取物的細(xì)胞毒性〔3〕。

1.4.5 肥大細(xì)胞組胺釋放量測(cè)定〔3〕在肥大細(xì)胞懸液中加入anti-DNP IgE(10 μg/L)致敏，在37℃孵育6 h。然后，分別加入黃梅木提取物高、中、低劑量(100、50、25 μg/L)組，氮卓斯汀(10 μg/L)作為陽性對(duì)照，作用10 min，洗凈，各組分別加入DNP-HSA(100 ng/ml)，孵育30 min，離心后取適量細(xì)胞上清液分別用于測(cè)定組胺。

1.4.6 肥大細(xì)胞內(nèi)鈣攝入量測(cè)定〔5〕在肥大細(xì)胞懸液中，放入含有 1 μCi45Ca2+/ml的 HERES-Tyrode緩沖溶液(MgCl2、CaCl2除外)，再懸浮。加入 anti-DNP IgE(10 μg/L)致敏，在37℃孵育6 h，分別加入黃梅木提取物和陽性對(duì)照氮卓斯汀，作用10 min，洗凈，各組分別加入 DNP-HSA(100 ng/ml)，孵育30 min。離心后除去上層液，用Triton-100破壞肥大細(xì)胞，計(jì)算出鈣離子量。

1.4.7 TNF-α、IL-6蛋白測(cè)定〔6〕在腹腔肥大細(xì)胞中加入anti-DNP IgE(10 μg/L)致敏，在37℃培養(yǎng)基孵育6 h，換洗后，加入黃梅木提取物作用10 min，洗凈，各組分別加入DNP-HSA(100 ng/ml)，孵育30 min。離心后除去上層液，加入裂解液，4℃離心，取上清液測(cè)蛋白濃度。取20 μg蛋白，經(jīng)12%SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉Tris-緩沖液(TBST)溶液室溫下封閉2 h，分別加入TNF-α及IL-6抗體4℃過夜，洗膜后再用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗雜交，37℃，1 h。洗膜后在暗室中加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑，顯影及定影。

2 結(jié)果

2.1 黃梅木提取物對(duì)PCA的影響 與模型組比較黃梅木提取物各治療組均能減少染料的滲出，其中高、中(400、200 mg/kg)劑量組與模型組比較差異顯著(P＜0.05)。見表1。

2.2 MTT測(cè)定結(jié)果 上述實(shí)驗(yàn)所用黃梅木提取物25～100 μg/L濃度對(duì)肥大細(xì)胞活性幾乎無影響。見表2。

2.3 黃梅木提取物對(duì)肥大細(xì)胞組胺生成和鈣攝入量影響 與模型組比較黃梅木提取物各治療組均能抑制組胺生成和鈣攝入量，其中高、中(100、50 μg/L)劑量組與模型組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.4 黃梅木提取物對(duì)TNF-α蛋白表達(dá)的影響 Western印跡條帶光密度分析顯示模型組TNF-α蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加9.3 倍，黃梅木提取物(25、50、100 μg/L)給藥 10 min 使 TNF-α蛋白表達(dá)分別下降7.8%、81%與87%。見圖1。

2.5 黃梅木提取物對(duì)IL-6蛋白表達(dá)的影響 Western印跡條帶光密度分析顯示模型組 IL-6蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加10倍，黃梅木提取物(10、25、50 μg/L)給藥10 min使 IL-6蛋白表達(dá)分別下降8.6% 、84%與87%。見圖2。

表1 黃梅木提取物對(duì)被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)的影響( s，n=8)

表1 黃梅木提取物對(duì)被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)的影響( s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 劑量(mg/kg)伊文思藍(lán)(μg/g)抑制率(%)0 56.25±2.65 -模型組 0 301.65±17.23 -黃梅木提取物組 100 266.32±13.81 14.51黃梅木提取物組 200 184.56±13.69 39.131)黃梅木提取物組 400 131.92±5.35 59.811)氮卓斯汀組 10 115.69±7.63 62.171)正常組

表2 黃梅木提取物對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺生成和鈣攝入量的影響( s，n=5)

表2 黃梅木提取物對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺生成和鈣攝入量的影響( s，n=5)

0 1.41±0.70 0.12±0.10 41.52±2.10模型組 0 1.38±0.72 1.32±0.14 150.86±4.96黃梅木組 25 1.41±0.52 1.14±0.15 129.81±4.87黃梅木組 50 1.47±0.59 0.79±0.231) 87.10±3.711)黃梅木組 100 1.48±0.75 0.31±0.311) 67.41±3.361)氮卓斯汀組 10 1.48±0.69 0.29±0.191) 55.63±2.911))正常組

圖1 不同藥物組肥大細(xì)胞TNF-α蛋白免疫印跡

圖2 不同藥物組肥大細(xì)胞IL-6蛋白免疫印跡

3 討論

抗原致敏機(jī)體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)可對(duì)其進(jìn)行識(shí)別并產(chǎn)生特異性抗體IgE，IgE可與肥大細(xì)胞表面的高親合性IgE Fc受體(FceRI)結(jié)合使細(xì)胞致敏。當(dāng)機(jī)體再次接觸抗原時(shí)，特異性IgE可與其結(jié)合，活化FceRI，從而誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放多種炎性介質(zhì)〔5〕。因此，如何有效地抑制肥大細(xì)胞脫顆粒就成為抗變態(tài)反應(yīng)藥物研發(fā)的重點(diǎn)。

被抗原激活的肥大細(xì)胞脫顆粒以后，釋放出TNF-α、IL-6等與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，然后引起過敏炎癥反應(yīng)〔6〕。TNF-α可由多種細(xì)胞合成，是重要的前炎癥因子，它可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集，并可刺激前列腺素、白三烯等因子的釋放。組胺可增強(qiáng)多種細(xì)胞合成分泌IL-6等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)過敏炎癥反應(yīng);組胺還可增強(qiáng)嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞的趨化反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的生成，對(duì)炎癥有促進(jìn)作用〔1〕。據(jù)研究報(bào)道，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度是抑制FceRI誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒的關(guān)鍵因素〔7〕。結(jié)果顯示黃梅木提取物呈劑量依賴性減少IgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞外鈣內(nèi)流，由此可抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和炎癥細(xì)胞因子的釋放;從體內(nèi)及體外觀察到黃梅木提取物抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的同時(shí)，也抑制了組胺、TNF-α、IL-6等與I型變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的因子，這可能是黃梅木提取物抗I型變態(tài)反應(yīng)的重要機(jī)制之一。

近年的研究結(jié)果揭示肥大細(xì)胞的脫顆粒與Lyn/Syk/LAT及Fyn/Gab2/PI3K兩條信號(hào)通路密切相關(guān)，黃梅木提取物是通過調(diào)節(jié)其中一條信號(hào)通路，還是對(duì)兩條信號(hào)通路均有作用，這將是下一步的研究重點(diǎn)。

1 顧 衛(wèi)，趙力建，趙愛國.杠柳苷元對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒及釋放組胺影響的研究〔J〕.中國藥房，2008;19(3):166-8.

2 魏圣淑，劉向前，吳世旭.韓國藥用植物黃梅木果實(shí)揮發(fā)油成分的GC-MS研究〔J〕.中草藥，2004;35(10):1097-8.

3 Choi YH，Yan GH.Silibinin attenuates mast cell-mediated anaphylaxislike reactions〔J〕.Biol Pharm Bull，2009;32(5):868-75.

4 Choi YH，Yan GH，Chai OH，et al.Inhibitory effects of agaricus blazei on mast cell-mediated anaphylaxis-like reactions〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(7):1366-71.

5 Choi YH，Yan GH.Ellagic acid attenuates immunoglobulin E-mediated allergic response in mast cells〔J〕.Biol Pharm Bull，2009;32(6):1118-21.

6 Kovarova M，Rivera J.A molecular understanding of mast cell activation and the promise of anti-allergic therapeutics〔J〕.Curr Med Chem，2004;11(15):2083-91.

7 Chai OH，Lee HK，Lee YC，et al.Roles of TNF-alpha and IgE in the late phase of contact hypersensitivity induced by trimellitic anhydride〔J〕.Exp Mol Med，2005;37(5):408-17.