向 文，李 琳，劉吉華*，余伯陽，2

青蒿素是由我國科學工作者，自主研發(fā)并在國際上注冊的為數不多的一類新藥之一。1971年屠呦呦等人在中國傳統醫(yī)藥寶庫中，發(fā)現并分離得到了具有抗瘧疾活性成分 -青蒿素(Artemisinin，QHS)，開創(chuàng)了人類抗瘧之路的一個新的里程碑，挽救了數百萬人的生命，并于2011年9月23日獲得國際醫(yī)學大獎-美國拉斯克(臨床研究獎)［1］。青蒿素是從菊科植物黃花蒿(Artemisia annua L.)中提取得到的一種新型倍半萜內酯的化合物，具有高效、快速、低毒的抗瘧活性，尤其對具有抗氯喹能力的腦瘧和急性瘧有效［2］。

近年來對青蒿素類成分的研究表明，青蒿素除了獨特的抗瘧作用外，該類藥還具抗寄生蟲、抗真菌、抗卡氏肺孢子蟲肺炎、抗心率失常、平喘及自身免疫調節(jié)等多種療效［3］。同時，青蒿素及其衍生物以其獨特的抗腫瘤機制和高效、低毒的抗腫瘤活性受到廣泛關注［4］。

通過化學合成獲得青蒿素已報道［5］，但由于其具有多個手性碳原子，使得合成步驟非常復雜，產率低、成本高，工業(yè)化生產很難實現。所以目前藥用青蒿素主要從黃花蒿植株中提取獲得［6］。因此，方便、快捷、準確檢測青蒿中青蒿素的含量對青蒿的選種培育、青蒿素類藥物生產及研究都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試品青蒿藥材分別采自重慶酉陽基地、安徽安慶和桐城、湖北恩施和赤壁吉林四平、山西太原、山東泰安和安丘、江蘇南京等10個地區(qū)，經中國藥科大學劉吉華教授鑒定。采集地上部分，陰干并粉碎后過60目篩，備用。

青蒿素對照品(批號:100202-200603)購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈 (色譜純，美國TEDIA)，純水(自制)，石油醚，甲醇，乙醇，丙酮，氯仿，乙酸乙酯(分析純，南京化學試劑廠)

1.2 實驗儀器

UPLC-1290色譜儀(安捷倫公司)，Agilent 1260 DAD檢測器，KQ-100型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，低溫離心機(BACKMAN公司)，RIOS-Elix純水器(Millipore公司)

1.3 實驗方法與結果

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm ×50 mm，1.8μm);流動相:乙腈-水(45∶55);流速:1.0 mL/min;柱溫:28℃;檢測波長:200 nm;進樣體積:1μL。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取0.5 g青蒿素對照品，置于容量瓶中加甲醇定容到50 mL，搖勻，即為10 mg/mL的對照品溶液。

精密量取 0.1，0.2，0.4，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0 mL置10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，過0.22μm的濾膜，取續(xù)濾液1uL進樣。以峰面積值A對進樣量C進行線性回歸，測定結果得標準曲線:A=109.41C+6.7 026，R2=0.9 993(n=9)。結果表明，進樣量在0.10 117-10.117 μg范圍內，青蒿素的峰面積與進樣量有良好的線形關系(見圖1)。

圖1 青蒿素的標準曲線

圖2 青蒿素的UPLC-UV色譜圖

圖3 基地(酉陽)藥材的UPLC-UV色譜圖

1.3.3 供試品的制備

精密稱取10種不同產地的藥材粉末0.3 g(每組3個平行)，置10 mL離心管中，加入5 mL的丙酮，稱量并記錄，超聲提取30 min，取出后補足損失，離心(4 000 r/min，10 min)取上清2mL，揮干溶劑，用乙腈定容到1 mL，過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液待用，即為供試品溶液。

1.3.4 不同產地藥青蒿中青蒿素的含量測定

將上述1.3.3制備所得的“供試品溶液”，進UPLC分析，并根據峰面積計算出藥材中的青蒿素的含量(見表1)。

表1 不同產地青蒿中青蒿素含量的比較

1.3.5 精密度

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次1μL，測得峰面積值，計算RSD為1.7%。

1.3.6 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 和 24 h進樣，測得其峰面積值，計算RSD為2.1%。

1.3.7 重復性

精密稱取同產地藥材粉末6份，每份為0.3 g，按“供試品溶液制備”項下操作，測定并計算青蒿素含量，6次測定值的RSD為2.3%，重現性良好。

1.3.8 加樣回收率

采用加樣回收法，取已知含量的同產地(基地)6份，每份0.15 g，精密稱定，分別精密加入適量青蒿素，按“供試品溶液制備”項下操作，測定并計算青蒿素的回收率，結果回收率為99.3%，RSD為2.6%。

2 討論

(1)本實驗考察了6種常用溶劑提取效率的影響，選擇了石油醚、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯為提取溶劑進行考察，結果表明丙酮提取效果較好，故選擇丙酮為提取溶劑。

(2)青蒿素等倍半萜類化合物大多紫外吸收很弱，本實驗采用末端吸收UPLC法測定青蒿中青蒿素的含量，同時選擇在200 nm，205 nm，209 nm 3個波長處進行含量測定。結果顯示，青蒿素在200 nm處的靈敏度較高且穩(wěn)定。

由于甲醇在紫外的末端也有一定吸收，為避免流動相的干擾，所選用的流動相為乙腈/水系統。

(3)根據實驗結果顯示，不同產地的青蒿藥材中青蒿素的含量差異很大，青蒿素的含量測定方法的改進有助于提高青蒿藥材質量的監(jiān)控。自青蒿素發(fā)現以來，關于青蒿素含量測定的方法很多［7］。95版藥典第一次收錄，采用紫外分光光度法檢測青蒿素的含量［8］，ELSD-HPLC法亦常用于青蒿素的含量測定［9-10］，柱前衍生化-HPLC法是也較常用的方法［11-13］。但是該方法樣品處理過程復雜，衍生試劑的濃度和加入量，反應溫度和時間，流動相緩沖鹽的種類和比例等因素都能對分析結果造成一定的影響。

與傳統的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度都比HPLC要高［14］。本實驗方法的特點在于樣品的處理簡單，適用于快速、準確地處理大批量的樣品，分析過程中受干擾因素較少，減少多步操作從而降低分析過程中人為因素帶來的誤差。從經濟角度來看，該方法大大縮短了分析周期、節(jié)約了人力物力、分析相同數量樣品所有溶劑量也大大減少了。

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［2］ 張積強，陳強，劉宗橋.抗瘧新藥青蒿素的研究［J］.陜西化工，1981，16(1):65-66.

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［7］ 張犇，鄒婷，王劍文.青篙素檢測方法的研究近況［J］.抗感染藥學，2008，5(4):201-204.

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［10］ 張東，楊嵐，屠呦呦，等.HPLC-UV-ELSD法同時測定青蒿中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量［J］.藥學學報，2007，42(9):978-981.

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