趙丹青，蘇肇秦，張衛(wèi)明，孫達(dá)峰，朱莉偉，蔣建新*

無(wú)患子(Sapondus mulorossi)是無(wú)患子科無(wú)患子屬的一種落葉喬木，在東南亞各國(guó)、我國(guó)的臺(tái)灣省及淮河以南各省均有分布，具有耐干旱貧瘠、生長(zhǎng)迅速、抗病蟲(chóng)害等特點(diǎn)［1］。無(wú)患子皂素是從無(wú)患子果皮中提取出的苷類化合物，主要包括以下類型:五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷、四環(huán)三萜類大戟烷型皂苷、達(dá)瑪烷型皂苷和倍半萜皂苷，其中以三萜類皂苷為主［2］。無(wú)患子皂素是一種天然的表面活性劑，具有良好的乳化、分散、發(fā)泡、濕潤(rùn)等功效，并且均有抗菌、鎮(zhèn)痛、消炎的藥理作用，可應(yīng)用于洗滌、醫(yī)藥、紡織、日用化工等領(lǐng)域。無(wú)患子皂苷的提取方法主要包括水提法和有機(jī)溶劑提取法。水提法得率較高，但也會(huì)同時(shí)將一些單糖、低聚糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等提取出來(lái)，從而使得提取物中皂苷純度偏低［1］。此外，水提法存在用水量大，廢水排放多等缺點(diǎn)。而有機(jī)溶劑法成本偏高，且部分有機(jī)溶劑具有一定程度的毒性。

超聲波作為一種高效節(jié)能的新興應(yīng)用技術(shù)，近年來(lái)在植物化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。超聲波作用于提取體系中，可以產(chǎn)生聲空化效應(yīng)，這種效應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力可以造成植物細(xì)胞壁的瞬間破壞，同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)可以促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，從而提高提取率［3］。目前超聲技術(shù)應(yīng)用于無(wú)患子皂素提取工藝未見(jiàn)報(bào)道，本課題就低水比下超聲輔助的無(wú)患子皂素提取工藝進(jìn)行研究，以期為無(wú)患子皂素的生產(chǎn)提供依據(jù)，提高生產(chǎn)效率，降低水耗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)患子果皮，產(chǎn)于福建，丙酮、無(wú)水乙醇、濃硫酸、香草醛均為分析純。

1.2 儀器

HF－5B超聲循環(huán)提取機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，B－260旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，UV－2000紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)，KQ－200VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)方法

采用紫外分光光度比色方法，顯色劑為香草醛－ 濃硫酸［4］。

1.3.1.1 試劑的配制

80 g/L香草醛溶液:0.8 g香草醛溶于10 mL無(wú)水乙醇;

體積分?jǐn)?shù)77%硫酸:硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%)77 mL加到23 mL去離子水中。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

取無(wú)患子果皮，粉碎過(guò)20目篩，取物料40 g，以液料比1∶4加入無(wú)水乙醇，在40℃下超聲提取30 min，功率800 W。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，用3倍體積丙酮沉降。濾渣烘干后用熱乙醇溶解，再加丙酮沉降，重復(fù)3次，得到黃褐色無(wú)患子皂素標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.1.3 50%乙醇為溶劑的定量方法

(1)精確稱取制得的無(wú)患子皂素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，溶于50%乙醇中，定容至25 mL;

(2)確定最大吸收波長(zhǎng):取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，準(zhǔn)確加入80%香草醛溶液0.5 mL，于冰水中加入77%硫酸液4 mL，搖勻，于60℃加熱15 min，然后置于冷水浴中冷卻10 min，取出后用紫外分光光度計(jì)在400－600 nm掃描;

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于帶塞試管中，并加水至溶液體積為0.5 mL，按(2)加試劑反應(yīng)后，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，并以吸光度對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.1.4 水為溶劑的定量方法

(1)稱取制得的無(wú)患子皂素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，溶解于水中，定容至25 mL;

(2)同1.3.1.3(2)步驟;(3)同1.3.1.3(3)步驟。

1.3.1.5 提取液皂素含量的測(cè)定

取無(wú)患子提取液樣品0.5 mL于比色管中，準(zhǔn)確加入80%香草醛溶液0.5 mL，于冰水中加入77%硫酸液4 mL，搖勻，于60℃加熱15 min，然后置于冷水浴中冷卻10 min，以未加入試劑的樣品為空白，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度

1.3.2 無(wú)患子皂素超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲時(shí)間、料液比、超聲功率和提取溫度進(jìn)行單因素探索，分別考察這五個(gè)因素對(duì)皂素收率的影響。

1.3.2.1 超聲時(shí)間

稱取約12 g的無(wú)患子果皮粉，以料液比1:6加入去離子水，超聲功率800 W，提取溫度60℃，反應(yīng)過(guò)程中使用香草醛－濃硫酸顯色法測(cè)定提取液中的皂素含量，得到皂素提取率隨超聲時(shí)間的變化曲線。

1.3.2.2 料液比

稱取約12 g的無(wú)患子果皮粉，分別以固液比1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8加入去離子水，超聲功率 800 W，提取溫度60℃，超聲時(shí)間20 min，使用香草醛－濃硫酸顯色法測(cè)定提取液中的皂素含量。

1.3.2.3 超聲功率

稱取約12 g的無(wú)患子果皮粉，以料液比1∶6加入去離子水，提取溫度60℃，超聲時(shí)間20 min，分別考察不同超聲功率 400、600、800、1 000、1 200 W 對(duì)皂素得率的影響。

1.3.2.4 提取溫度

稱取約12 g的無(wú)患子果皮粉，以料液比1∶6加入去離子水，超聲時(shí)間20 min，功率800 W，考察不同溫度 30、40、50、60、70 ℃對(duì)皂素得率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)患子皂素UV定量方法

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)

兩種溶劑顯色體系的全波長(zhǎng)掃描如圖1所示，分別在462 nm(50%乙醇)和540 nm(水)處得到最大吸收，與魏鳳玉等［5］及楊志斌等［6］得到的無(wú)患子皂素最大吸收峰接近(分別為478 nm和541 nm)。比較兩條吸收曲線可見(jiàn)，以50%乙醇為溶劑時(shí)，出現(xiàn)單峰且吸光度較高;而以水為溶劑時(shí)，峰值吸光度較低，且540 nm也是還原糖的最大吸收波長(zhǎng)，若選擇此波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，將會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大影響。因此選擇50%乙醇作為檢測(cè)溶劑。由于本研究中無(wú)患子皂素提取采用水為溶劑，因此在檢測(cè)前需加入相同體積的無(wú)水乙醇。

圖1 兩種溶劑(50%乙醇和水)的全波長(zhǎng)掃描

2.1.2 顯色溫度和顯色時(shí)間

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，三萜類皂苷檢測(cè)時(shí)的溫度大多在60～80℃，為探索溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同顯色溫度下的吸光度，結(jié)果如表1所示。吸光度隨著溫度的上升發(fā)生少量的增加，對(duì)結(jié)果影響很小，所以實(shí)驗(yàn)選擇最低溫度60℃作為顯色溫度。此外，在60℃下改變顯色時(shí)間，結(jié)果如表2所示。隨著顯色時(shí)間的增長(zhǎng)，吸光度逐漸增加，顯色反應(yīng)越完全。10 min的吸光度較高，且與15 min吸光度較接近，因此確定顯色時(shí)間為15 min。

表1 加熱溫度的選擇

表2 顯色時(shí)間的選擇

2.1.3 穩(wěn)定性

為了考察測(cè)試方法的穩(wěn)定性，在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)定已顯色的樣品溶液的吸光度，結(jié)果如表3所示。顯色后10 min內(nèi)吸光度較穩(wěn)定，15 min后發(fā)生較大增長(zhǎng)。一個(gè)可能的原因是乙醇的揮發(fā)造成溶液顏色加深，使得吸光度升高。在魏鳳玉等［5］的研究中，當(dāng)顯色時(shí)間從50 min延長(zhǎng)到60 min時(shí)，吸光度產(chǎn)生了明顯的下降。這與我們的檢測(cè)結(jié)果相反。他們的解釋是，顯色反應(yīng)生成的絡(luò)合物也可能在空氣中氧化變性，造成吸光度的下降。因此，對(duì)吸光度的檢測(cè)應(yīng)該在顯色反應(yīng)后的10 min內(nèi)進(jìn)行，并注意比色管的密封。

表3 吸光度隨放置時(shí)間的變化

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在462 nm下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。得到吸光度(A)與皂素濃度(C)的關(guān)系為:C=0.3201A+0.063，R2=0.9998。即無(wú)患子皂苷在0.1～0.5 mg/mL內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。則根據(jù)下式計(jì)算樣品中的無(wú)患子皂素含量:

其中:A為樣品吸光度，V為樣品體積 (mL)，m為樣品質(zhì)量(mg)，N為稀釋倍數(shù)。

2.1.5 加標(biāo)回收率

精確吸取無(wú)患子提取液100μL，分別30、40、50、60、70μL無(wú)患子皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度:1 mg/mL)，用分光光度法測(cè)定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率。如表4所示，平均加標(biāo)回收率為102.05%，RSD為1.53%(n=5)，所以此檢測(cè)方法可信度較高，檢測(cè)結(jié)果接近真實(shí)值。

圖2 無(wú)患子皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)皂素提取的影響

原料以料液比1∶6加入去離子水，超聲功率800 W，提取溫度60℃，考察不同超聲提取時(shí)間對(duì)皂素提取的影響(圖3)。從結(jié)果可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，皂素的得率也隨之升高。20 min時(shí)，提取率為37.21%，而當(dāng)時(shí)間進(jìn)一步增長(zhǎng)時(shí)，皂素得率并沒(méi)有大幅提高。這是因?yàn)楣桃航缑鎸拥脑硭貪舛忍荻仁浅暦ㄌ崛〉闹饕苿?dòng)力，提取初期，固相和液相的皂素濃度差較大，因此提取速率快，提取率增加明顯，而隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑中皂素的濃度逐漸增大，與固相的濃度差逐漸減小，因而推動(dòng)力變小，所以提取速率減緩，提取率增加不明顯，直至推動(dòng)力為零，皂素不再溶出，提取達(dá)到平衡。所以20 min以后，延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)提取的增進(jìn)作用不明顯?；谝陨显硪约皩?duì)能耗的考慮，確定20 min為最適超聲提取時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)皂素提取得率的影響

2.3 料液比對(duì)皂素提取的影響

原料中加入一定量去離子水，超聲功率800 W，提取溫度60℃，超聲時(shí)間20 min，考察不同料液比(原料質(zhì)量與溶劑體積之比，g·mL－1)對(duì)皂素提取的影響(圖4)。當(dāng)加水比從1∶4提高到1∶6時(shí)，皂素提取得率由34.20%上升到了37.32%。提高加水比可以增進(jìn)原料與水的有效接觸，增加傳質(zhì)面積［7］，提高細(xì)胞壁內(nèi)皂苷向水?dāng)U散的速率，從而提高提取得率。而當(dāng)加水比超過(guò)1∶6時(shí)，提取得率的增幅已經(jīng)很小。這說(shuō)明當(dāng)液料比足以保證溶劑完全浸潤(rùn)物料并有效溶解皂素后，傳質(zhì)面積固定，加水比德進(jìn)一步提高將不再影響固液傳質(zhì)速率，反而會(huì)增加溶劑投入和回收成本，帶來(lái)不必要的能耗。故綜合考慮采取1∶6的液料比進(jìn)行提取。

圖4 料液比對(duì)皂素提取率的影響

2.4 超聲功率對(duì)皂素提取的影響

原料以料液比1∶6加入去離子水，提取溫度60℃，超聲時(shí)間20 min，考察不同超聲功率對(duì)皂素提取的影響(圖5)。由圖可以看出，皂素提取得率隨著超聲功率的升高而先升后降，在1 000 W有皂苷最大提取率(37.40%)。這是由于對(duì)于一定頻率和一定發(fā)生面的超聲波來(lái)說(shuō)，功率增大，聲強(qiáng)(功率/面積)隨之增大，從而聲壓幅值以及液體中的壓力也增大，空化泡崩塌所需的時(shí)間將縮短。因此單位時(shí)間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)增多，從而有利于皂素的溶出。而當(dāng)聲強(qiáng)繼續(xù)增大時(shí)，過(guò)高的聲強(qiáng)產(chǎn)生出大量空泡，這些空泡會(huì)反射聲波，減少能量的傳遞，不利于提?。?］。另外，由于超聲處理的無(wú)選擇性，高強(qiáng)度的超聲處理會(huì)使空化作用在打破細(xì)胞壁的同時(shí)破壞皂素結(jié)構(gòu)，造成皂素的損耗。因此，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了皂素提取率先升高后降低的現(xiàn)象。由于800 W和1 000 W下的皂苷提取率接近，且出于對(duì)節(jié)能因素的考慮，選擇800 W作為最適超聲頻率。

圖5 超聲頻率對(duì)皂素提取得率的影響

2.5 溫度對(duì)皂素提取的影響

原料以料液比1∶6加入去離子水，超聲時(shí)間20 min，功率800 W，考察不同溫度對(duì)皂素提取的影響(圖6)。皂素提取得率隨著溫度上升而提高，并在60℃達(dá)到最大值(37.36%)。這是由于溫度的升高可以降低溶液粘度，促進(jìn)擴(kuò)散;另一方面，粘滯系數(shù)的下降有利于空化泡的產(chǎn)生，增進(jìn)空化作用，因而增進(jìn)皂素的提取。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高至70℃時(shí)，提取率發(fā)生了大幅下降，這可能是由于升高溫度導(dǎo)致的蒸汽壓上升會(huì)使得空化強(qiáng)度或空化效應(yīng)下降，從而不利于提取過(guò)程的強(qiáng)化。同時(shí)，過(guò)高溫度對(duì)超聲換能器的壓電性能會(huì)有影響［9］。因此選擇60℃作為最適溫度。

圖6 提取溫度對(duì)皂素提取率的影響

3 小結(jié)

無(wú)患子果皮占到全果的55.6%［10］，采用超聲波輔助法從無(wú)患子果皮中提取皂素是可行并且有效的。在超聲波作用下提取無(wú)患子皂素的得率受多種因素影響，如超聲提取時(shí)間、料液比、超聲功率和提取溫度等，實(shí)驗(yàn)得出較佳的提取工藝參數(shù)為:超聲頻率20 kHz，超聲時(shí)間 20 min，料液比 1∶6，超聲功率800 W，提取溫度60℃，皂素提取得率為37.27%。低水比超聲波輔助法提取無(wú)患子皂素可以減少過(guò)程用水量，降低能耗，提高皂素得率。

致謝:本項(xiàng)目研究原料由福建三青生態(tài)農(nóng)林發(fā)展有限公司協(xié)助采集，表示感謝!

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