余 艷，羅 振(綜述)，程臘梅(審校)

(中南大學(xué)生殖與干細胞研究所，長沙 410078)

造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)具有高度自我更新、多向分化潛能，能長期重建各系造血和免疫功能。HSCs移植是治療白血病、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病和某些實體瘤(淋巴瘤、乳腺癌等)的有效手段。自1989年首次利用臍血干細胞移植治療范科尼貧血報道以來，臍血干細胞移植受到了廣泛的關(guān)注。但由于臍血中HSCs的數(shù)量有限，臍血干細胞移植治療主要應(yīng)用于兒童和低體質(zhì)量患者。為滿足大齡兒童和成年患者臍血HSCs移植的需求，需通過體外擴增獲得足夠數(shù)量的HSCs。近年來隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，人們對HSCs生物學(xué)和造血調(diào)節(jié)有了更深入的了解，HSCs體外擴增效率得到了極大的提高。

1 添加細胞因子擴增HSCs

將骨髓、外周血或臍血來源的HSCs，置于含有多種細胞因子的培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)是早期體外擴增HSCs的主要方法。不同實驗室所用細胞因子組合也不盡相同，但是通常都含有干細胞因子(stem cell factor，SCF)、白細胞介素(interleukin，IL)-3、IL-6 和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)，F(xiàn)lt-3/Flk2配體(Flt-3/Flk-2 Ligand， FL)。SCF和FL主要作用造血干/祖細胞，促進造血干/祖細胞分裂和增殖，抑制凋亡［1］;IL-3主要刺激造血祖細胞的增殖和分化［2］;TPO 能夠廣泛作用于造血細胞的各個階段，主要調(diào)節(jié)巨核細胞系的分化［3］。應(yīng)用上述細胞因子組合擴增HSCs，雖然造血細胞的總數(shù)和造血祖細胞數(shù)量得到了顯著的擴增，但原始HSCs在體外擴增過程中發(fā)生分化，擴增后的造血細胞降低了自我更新和重建造血的能力［4］。因此，在擴增HSCs的同時，如何維持干細胞特性是HSCs體外擴增中亟待解決的問題。

近年來，人們對造血微環(huán)境的調(diào)控作用有了更深入的了解，發(fā)現(xiàn)造血微環(huán)境中的某些蛋白質(zhì)對維持HSCs的不分化和自我更新具有重要作用，因此嘗試將這些蛋白質(zhì)用于HSCs的體外擴增。原始HSCs表達Notch信號分子受體，活化Notch信號能抑制HSCs分化，促進HSCs增殖，但是Notch的配體Delta-1在可溶狀態(tài)下雖能與Notch結(jié)合，卻不能活化該信號通路［5］。Delaney等［6-7］將 Delta-1 的胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列與IgG1的Fc域的編碼序列融合，純化得到Delta-1 ext-IgG;在體外擴增培養(yǎng)時先將Delta-1ext-IgG固定于培養(yǎng)器皿中，固定化的Delta-1 ext-IgG能夠激活 HSCs的 Notch信號通路;利用固定化的Delta-1ext-IgG輔以細胞因子 SCF、FL、IL-6、IL-3、TPO擴增HSCs，培養(yǎng)17～21 d，CD34+細胞擴增達222倍，同時造血重建能力增強16倍。

Wnt蛋白是一類分泌型糖蛋白，參與HSCs的自我更新和分化的調(diào)節(jié)。β連鎖蛋白是Wnt信號通路中重要的信號分子，Wnt蛋白與受體結(jié)合后抑制β連鎖蛋白的磷酸化，導(dǎo)致胞內(nèi)β連鎖蛋白聚集，繼而進入細胞核與T細胞因子/淋巴增強因子家族作用，促進特定基因的表達?；罨摩逻B鎖蛋白或Wnt1的過量表達能夠抑制HSCs分化，促進HSCs的增殖［8］。此外，地諾前列酮也可通過上調(diào)β連鎖蛋白的表達作用于Wnt信號通路，參與HSCs增殖和分化的調(diào)節(jié)［9］。

多效蛋白(pleiotrophin，PTN)是在許多組織和細胞系中廣泛表達的分泌型肝素結(jié)合蛋白，該蛋白不僅調(diào)節(jié)細胞增殖和遷移，還參與血管的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)PTN對小鼠HSCs的維持至關(guān)重要，同時還能促進人臍血HSCs的體外擴增。Himburg等［10］運用PTN聯(lián)合細胞因子SCF、FL和TPO擴增人臍血CD34+CD38-細胞，HSCs可擴增近40倍;將擴增后的細胞移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，4周后檢測到小鼠外周血中人源的細胞數(shù)是對照組的3倍，8周后增加至7倍。

2 添加化學(xué)分子擴增HSCs

臨床研究發(fā)現(xiàn)銅離子(Cu2+)在HSCs的發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，Cu2+能使細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡。體外培養(yǎng)臍血干細胞時，Cu2+能夠增加活性氧的濃度，促進HSCs分化;在含有細胞因子(SCF、TPO、FL和 IL-6)的培養(yǎng)體系中加入Cu2+螯合劑四乙烯戊胺(tetraethylenepentamine，TEPA)，CD34+細胞可擴增159倍，為對照組的 3.5 倍［11］。HSCs擴增劑(StemRegenin 1，SR1)是一種嘌呤衍生物，在含SCF、FL和IL-6細胞因子的無血清培養(yǎng)體系中，加入SR1，人臍血CD34+細胞可擴增50倍，SRCs擴增達17倍［12］。

p38是屬于細胞分裂素活化蛋白激酶家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，參與調(diào)節(jié)多種細胞的分化、衰老和凋亡過程。當內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時，p38在HSCs的自我更新和正常的造血過程中不發(fā)揮作用，但是在氧化應(yīng)激條件下活化的p38則誘導(dǎo)HSCs衰老［13-14］。SB203580是一種小分子化合物，能夠特異性抑制p38的活性。在正常的含氧條件下(21%)p38的活化抑制HSCs的擴增，加入SB203580后，HSCs的擴增效率增加2 倍［15］。

3 基質(zhì)細胞共培養(yǎng)擴增HSCs

HSCs自我更新、多向分化均依賴于HSCs所處的微環(huán)境。微環(huán)境中的基質(zhì)細胞、基質(zhì)細胞分泌的細胞因子和細胞外基質(zhì)及造血細胞本身均參與造血穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。骨髓造血微環(huán)境中的基質(zhì)細胞包括成纖維細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、網(wǎng)狀細胞、脂肪細胞和間充質(zhì)細胞，這些基質(zhì)細胞在體外對HSCs均有不同程度的擴增作用［16］。Kawano等［17］將人端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細胞建立基質(zhì)細胞系，支持臍血CD34+細胞體外增殖。骨髓間充質(zhì)干細胞也具有擴增HSC/HPC的作用，臍血單個核細胞與充質(zhì)細胞共培養(yǎng)14 d，CD133+細胞和CD34+細胞可分別擴增30倍和8倍，集落形成單位擴增約200倍［18］。小鼠骨髓基質(zhì)細胞來源的OP9細胞系轉(zhuǎn)染Delta-1基因后，在擴增造血HSCs的同時，能有效地促進CD34+CD38-Lin-的自我更新［19］。此外，內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)也能有效促進HSCs的體外擴增。在共培養(yǎng)體系中，ECs表達的Notch配體，激活HSCs的 Notch信號，抑制 HSCs的分化，促進HSCs增殖的同時能保持HSCs的自我更新潛能［20］。轉(zhuǎn)染了E4ORF1基因的ECs(E4ORF1+ECs)能夠在無血清和細胞因子的條件下長期培養(yǎng)［21］。為了排除ECs生長所需的生長因子對HSCs擴增的影響，Butler等［20］利用 E4ORF1+ECs與 HSCs在無血清和細胞因子的情況下進行共培養(yǎng)，擴增后的HSCs能夠長期植入所有的受體小鼠體內(nèi)?；|(zhì)細胞共培養(yǎng)較單純用細胞因子的培養(yǎng)體系，擴增HSCs的效率更高，但共培養(yǎng)體系成分復(fù)雜，影響因素較多，不便于大規(guī)模的擴增培養(yǎng)和標準化，并且異體的基質(zhì)細胞有排斥和傳播疾病的風(fēng)險，不適合臨床上的應(yīng)用。

4 HSC基因修飾

SALL4是一種新發(fā)現(xiàn)的含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，對胚胎干細胞多能性的維持至關(guān)重要［22］。SALL4在人白血病細胞系和早期急性髓性白血病細胞中表達，可能與正常HSCs的自我更新有關(guān)［23-24］。SALL4基因過表達的CD34+細胞在體外擴增培養(yǎng)2個月后，HSC擴增可達10 000～15 000倍，并且植入能力和長期重建造血能力均得到顯著增強［25］。

除了HSCs體外擴增效率外，HSCs的植入率也是影響HSCs移植成功與否的關(guān)鍵。CD34+細胞過表達CXCR4基因，能夠增強基質(zhì)細胞衍生因子1介導(dǎo)的趨化作用，增加HSCs移植后的植入率，提高HSCs移植的成功率［26］。

5 其他方法

骨髓血液中的氧張力較其他組織低，相當于頸靜脈血的氧張力［27］。細胞周期緩慢的HSCs趨向于定植在遠離血管的低氧區(qū)，細胞周期活躍的HSCs位于血管附近的區(qū)域［28］。低氧條件培養(yǎng)CD34+細胞能夠提高其植入后造血重建能力［29］。低氧環(huán)境中的HSCs保持低的擴增速率避免氧化應(yīng)激的損傷，并且能夠表達更高水平的Notch-1、端粒酶和細胞周期抑制因子 p21［30］。

納米纖維是一種能滲透的纖維，具有可控制的拓撲特性，這種結(jié)構(gòu)能夠顯著提高表面積與體積比。以納米纖維作為支架材料，模擬體內(nèi)造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)擴增HSCs，能明顯提高HSCs的擴增效率。將網(wǎng)狀的納米纖維材料黏附于24孔培養(yǎng)板底部，將臍血來源的CD133+細胞加入到納米材料制成的支架上進行擴增培養(yǎng)，擴增培養(yǎng)10 d后細胞總數(shù)增加了225倍，并且仍高表達 CD133(24%)和 CD34(93%)［31］。近年來用旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器來擴增培養(yǎng)HSC，細胞數(shù)可擴增435倍，CD34+細胞擴增 30 余倍［32］。生物反應(yīng)器的利用避免了共培養(yǎng)異體基質(zhì)細胞疾病傳播的風(fēng)險，降低了成本，具有極大的應(yīng)用價值。

6 展望

進一步優(yōu)化HSCs擴增培養(yǎng)體系，提高HSCs的擴增效率，為臨床移植治療提供充足的HSCs，需要更加深入地研究HSCs增殖、分化機制，尋找最佳的細胞因子組合，并利用生物工程技術(shù)，建立更加優(yōu)化的大規(guī)模培養(yǎng)裝置。另外，可通過尋找新的HSCs來源，以滿足日益增長的HSCs需求，例如利用胚胎干細胞或誘導(dǎo)多潛能干細胞在體外向造血定向誘導(dǎo)分化。此外，擴增的HSCs用于臨床前還需要進行大量的隨機臨床試驗，以驗證其安全性和有效性。隨著干細胞領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展，移植技術(shù)的不斷完善，擴增的臍血HSCs將更加廣泛地應(yīng)用于臨床治療中。

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