宋建明，黃秀清，林燕惠，張 敏

（1.莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，福建 莆田351100；2.莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，福建 莆田351100）

變應(yīng)性鼻炎大鼠模型的建立

宋建明1，黃秀清1，林燕惠1，張 敏2

（1.莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，福建 莆田351100；2.莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，福建 莆田351100）

目的：建立變應(yīng)性鼻炎 （AR）Wistar大鼠模型，探討呼吸道變應(yīng)性炎癥的發(fā)病機制，為臨床治療AR提供實驗依據(jù)。方法：將30只Wistar大鼠隨機分成模型組、正常組和地塞米松 （DEX）組，每組10只。模型組大鼠經(jīng)腹腔注射卵清蛋白 （OVA）變應(yīng)原，鼻腔滴入OVA鼻內(nèi)激發(fā)；正常組大鼠以生理鹽水替代OVA；DEX組大鼠激發(fā)成AR后再用DEX （0.2mL·kg－1）后肢肌肉注射，觀察大鼠行為學(xué)癥狀；采用HE染色和免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠鼻黏膜組織學(xué)變化、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及其鼻黏膜免疫球蛋白E（IgE）的吸光度（A）值。結(jié)果：模型組大鼠均出現(xiàn)鼻癢、噴嚏和流清涕等AR的臨床特征，大鼠鼻黏膜可見大量的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜水腫增厚、腺體增生、分泌旺盛和鼻黏膜表面纖毛破壞等組織形態(tài)學(xué)變化。正常組大鼠僅輕度抓鼻，且噴嚏少。DEX組Wistar大鼠小血管無明顯擴張，黏膜厚度較模型組明顯降低，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕。模型組和DEX組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及其A值均高于正常組 （P＜0.05），DEX組大鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及A值均低于模型組 （P＜0.05）。結(jié)論：成功建立OVA變應(yīng)原致敏的AR Wistar大鼠模型。

變應(yīng)性鼻炎；疾病模型，動物；卵清蛋白；嗜酸性粒細(xì)胞；免疫球蛋白E

變應(yīng)性鼻炎 （allergic rhinitis，AR）是發(fā)生在鼻黏膜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，是主要由IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)。AR是變應(yīng)原致敏激發(fā)產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)，導(dǎo)致黏膜的各種病理改變，包括毛細(xì)血管通透性增高、黏膜水腫、多形核細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤的一種慢性鼻黏膜炎癥性疾病。近幾十年來，由于人們生活方式的改變和環(huán)境污染的加重，該病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢［1］。AR發(fā)病機制十分復(fù)雜，國內(nèi)外眾多學(xué)者對AR的研究［2－4］均是通過實驗性動物模型實現(xiàn)的。豚鼠是最早被用來建立變應(yīng)性模型的動物，早在1988年 Tanaka等［5］就利用甲苯二異氰酸酯建立豚鼠AR模型。本研究以Wistar大鼠為研究對象，通過注射卵清蛋白（ovalbumin，OVA）變應(yīng)原致敏，觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)和組織學(xué)的改變，旨在制備實驗性AR模型，為進一步探討呼吸道變應(yīng)性炎癥的發(fā)病機制及臨床研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器 30只健康 Wistar大鼠購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SPF級，5～6周齡，體質(zhì)量120～150g，隨機分為正常組、模型組和地塞米松 （dexamethasone，DEX）組，每組10只。實驗動物分籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，在空調(diào)動物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房避免過敏原存在，早晚12h間斷照明，溫度保持在18～25℃。OVA（美國Sigma公司）；氫氧化鋁、10%水合氯醛（北京化學(xué)試劑公司）；DEX注射液、IgE （美國R＆D公司）；SP二步法試劑盒 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；光學(xué)顯微鏡 （上海儀圓光學(xué)儀器有限公司）；可調(diào)移液器 （芬蘭Finnpipette Digital公司）；5mL注射器、電子天平 （英國A1003Pharmacia Biotech公司）。

1.2 動物分組及給藥［6－7］基礎(chǔ)致敏過程：模型組，0.3mg OVA加15mg Al（OH）3混于1mL生理鹽水中，按大鼠體質(zhì)量隔日行腹腔注射，共14d；正常組，以等量生理鹽水替代OVA混懸液，按大鼠體質(zhì)量隔日行腹腔注射，共14d；DEX組，基礎(chǔ)致敏的方法和步驟同模型組。激發(fā)階段：模型組，以0.1g·L－1OVA每日滴鼻維持過敏狀態(tài)，共7d；正常組，用生理鹽水代替OVA每日滴鼻，共7d；DEX組，用0.1g·L－1OVA每日滴鼻，同時用0.2mL·kg－1DEX后肢肌肉注射，共7d。

1.3 大鼠AR模型成功判定標(biāo)準(zhǔn) 通過激發(fā)實驗，模型大鼠會出現(xiàn)打噴嚏、撓鼻、抓臉和鼻溢等癥狀。趙秀杰等［8］在給藥后30min內(nèi)對上述癥狀建立了評分系統(tǒng)。鼻癢：輕度為1分，輕擦鼻幾次；重度為2分，抓撓鼻、面不止，到處擦磨。噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分。清涕：流到鼻前孔為1分，過鼻前孔為2分，流涕滿面為3分。以疊加法記錄總分，總分超過5分即為建模成功。

1.4 AS標(biāo)本制備 大鼠末次激發(fā)24h后，用10%水合氯醛 （300mg·kg－1）行腹腔注射，麻醉后將大鼠心臟放血處死，迅速打開鼻背，剝?nèi)ド项M骨部皮膚，沿右側(cè)鼻中隔外側(cè)前庭壁剪斷，向上翻開暴露鼻中隔和雙側(cè)鼻腔，取雙側(cè)鼻中隔黏膜，固定于10%中性甲醛溶液中過夜后，先后放在20%和30%蔗糖溶液中分別過夜，然后制成切片，進行免疫組織化學(xué)染色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞 采用SP法染色，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2室溫10min，微波抗原修復(fù)10min，冷卻，PBS沖洗，非免疫血清封閉20min，PBS沖洗，加一抗 （IgE 1∶200）4℃過夜；滴加生物素化二抗室溫靜置20min，PBS沖洗，滴加100μL新配制的DAB液，顯微鏡下觀察，顯色約2min、雙蒸餾水沖洗、蘇木精復(fù)染、脫水、透明和封片，光鏡下觀察各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及其IgE的吸光度 （A）值。

1.6 免疫組織化學(xué)法測定IgE吸光度 （A）值采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠反應(yīng)切片中選取的形態(tài)典型的對應(yīng)切面，所得圖像經(jīng)SimpPCI圖像分析系統(tǒng)分析。在不同鼻黏膜切片間測量相同解剖結(jié)構(gòu)區(qū)，每一解剖區(qū)各測5個點，每個測量點測量的像素量 （即被測量面積）保持一致。以上每個解剖區(qū)測量值總和的平均值即為鼻黏膜結(jié)構(gòu)區(qū)域的最終A值，通過A值間接反映大鼠鼻黏膜表面IgE的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組大鼠行為學(xué)評分、鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及其IgE的A值以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 模型組10只 Wistar大鼠打噴嚏均多于11個，持續(xù)抓鼻，臉部布滿鼻分泌物，總評分 ＞5分。DEX組大鼠致敏期和激發(fā)第1次開始出現(xiàn)明顯的抓鼻、打噴嚏和流鼻涕癥狀，總評分＞5分，激發(fā)后期，癥狀逐漸緩解；DEX組大鼠的鼻噴嚏平均次數(shù)較模型組的鼻噴嚏平均次數(shù)明顯減少。正常組10只Wistar大鼠僅有輕度抓鼻，且噴嚏少，總評分 ＜5分。各組大鼠癥狀評分變化見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)癥狀評分Tab.1 The behavior symptom scores of rats in various groups （n＝10，±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)癥狀評分Tab.1 The behavior symptom scores of rats in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with nomal group；△P＜0.05compared with model group.

Group Symp 02 0.70±0.78 0.80±0.78 1.10±0.89 Model 4.98±0.57＊ 5.60±0.54＊ 5.00±1.29＊ 6.20±0.66＊ 6.60±0.76＊ 7.00±0.83＊ 7.10±0.99＊DEX 4.97±0.46＊△ 4.89±0.88＊△ 4.40±1.10＊△ 3.96±0.98＊△ 3.78±0.76＊△ 3.12±0.87＊△ 3.17±0.21＊1 2 3 4 5 6 7 Nomal 0.40±0.51 0.59±0.65 0.60±0.66 1.00±1.tom score（t／d）△

2.2 各組大鼠鼻黏膜組織學(xué)表現(xiàn) 模型組大鼠鼻黏膜組織中有大量嗜酸性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞有脫落，杯狀細(xì)胞化生、肥大，黏膜間質(zhì)水腫增高，腺體增生肥大、分泌旺盛且鼻黏膜表面纖毛破壞等。正常組大鼠鼻黏膜上皮完整，呈柱狀排列，未見嗜酸性粒細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞浸潤。DEX組大鼠小血管無明顯擴張，黏膜厚度較模型組明顯降低，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕。見圖1（插頁三）。

2.3 各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和鼻黏膜IgE表達(dá)平均A值 模型組和DEX組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和A值均高于正常組 （P＜0.05）；DEX組大鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和A值低于模型組（P＜0.05）。見表2和圖2 （插頁三）。

表2 各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和IgE表達(dá)A值Tab.2 The numbers of eosinophile granulocytes and A values of IgE of rats in various groups （n＝10，±s）

表2 各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和IgE表達(dá)A值Tab.2 The numbers of eosinophile granulocytes and A values of IgE of rats in various groups （n＝10，±s）

＊P＜0.05compared with nomal group；△P＜0.05compared with model group.

Group No.of eosinophile granulcoytes A value of IgE Nomal 0.45±0.56 22.46±1.46 Model 11.78±2.24＊ 39.56±4.58＊DEX 7.12±2.12＊△ 25.34±4.43＊△

3 討 論

建立有效可行的大鼠AR模型，可以更有效地研究該疾病的發(fā)病機制，克服人體實驗的局限性。目前國內(nèi)外制備AR模型尚未統(tǒng)一和標(biāo)準(zhǔn)化，造模使用的致敏原、免疫佐劑致敏和激發(fā)的方法、途徑和試劑等也不完全相同。致敏原有真菌性抗原致敏［9］、豚草花粉變應(yīng)原致敏［10］等。本實驗中模型組大鼠經(jīng)OVA長期刺激，產(chǎn)生過敏反應(yīng)，使鼻部黏膜炎癥長期存在，促進了IgE的合成并使組織內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量增加［11－13］，表現(xiàn)為鼻黏膜組織中有大量嗜酸性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞化生、肥大，黏膜間質(zhì)水腫加重，腺體增生肥大、分泌旺盛，鼻黏膜表面纖毛破壞等，鼻黏膜部的IgE的A值高于正常組。DEX組大鼠中，DEX可抑制白細(xì)胞的黏附，降低免疫蛋白超家族黏附分子1／黏合素分子1（ICAM－1／LFA－1）間相互作用，使AR的癥狀得到一定的緩解，同時DEX防止或抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，減少嗜酸性細(xì)胞的數(shù)目，使DEX組大鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)低于模型組，與模型組和正常組比較，DEX組大鼠的癥狀較輕，同時大鼠鼻黏膜部IgE的含量較模型組大鼠降低。

通過動物疾病模型來研究人類疾病，可以觀察到無法在患者身上進行實驗的各種致病因素對人體的作用，同時還可克服人類疾病發(fā)生、發(fā)展緩慢，潛伏期長，發(fā)病原因多樣，經(jīng)常伴有各種其他疾病等因素的干擾，可以用單一的病因，在短時間內(nèi)復(fù)制出典型的動物疾病模型。動物模型是研究人類各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和疾病防治的重要工具之一。

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Establishment of allergic rhinitis models of rats

SONG Jian－ming1，HUANG Xiu－qing1，LIN Yan－h(huán)ui1，ZHANG－Min2
（1.Department of Clinical Medicine，College of Medical Sciences，Putian University，Putian 351100，China；2.Department of Physiology，College of Medical Sciences，Putian University，Putian 351100，China）

ObjectiveTo establish allergic rhinitis（AR）models of Wistar rats，and to discuss the pathogenesis of allergic inflammation of respiratory tract，and to provide basis for clinical treatment of AR.Methods30Wistar rats were randomly divided into model group （n＝10），normal group （n＝10）and dexamethasone （DEX）group（n＝10）.The rats in model group were immunized intraperitoneally with ovalbumin （OVA），followed by intranasal administration of OVA；and the rats in normal group were adminstrated with saline instead of OVA；the rats in DEX group were challenged into AR，then they were injected with 0.2mL·kg－1dexamethasone muscle of hind legs.The behavioral symptoms，histological changes of nasal mucosa，the number of eosinophile granulocytes and the expression levels of IgE were detected by HE staining and immunohistochemical methods.ResultsThe AR symptoms，such as nasal itching，sneezing，and rhinorrhea of the rats in model group were observed.There were a lot of histological changes，such as eosinophile granulocytes，lymphocytes，edema of the mucosa，gland hyperplasia，strong secretion，and cilia destruction on nasal surface of the rats in model group.There were only mild grasping nose and a small amount of sneezing of the rats in normal group.The small blood vessels of the rats in DEX group had no significant expansion，the mucosal thickness was lower than that in model group and the degree of inflammatory cell infiltration was alleviated.The numbers of eosinophile granulocytes and their A values of the rats in DEX group and model group were higher than those in nomal group （P＜0.05）.The number of eosinophile granulocytes and its A value of the rats in DEX group were lower than those in model group （P＜0.05）.ConclusionThe AR rat model induced by OVA is established successfully.

allergic rhinitis；disease model，animal；ovalbumin；eosinophile granulocytes；immunoglobutin

R765.21

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1152－04

2012－05－06

福建省莆田市科技局科研基金資助課題 （2010G06）；莆田學(xué)院創(chuàng)新實驗項目資助課題 （2010P11352）

宋建明 （1988－），男，福建省莆田市人，醫(yī)學(xué)本科，主要從事變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機制方面的研究。

張 敏 （Tel：0594－2694201，E－mail：zm5995＠sina.com）