申 晴， 崔莉鳳， 趙 碩

(1．北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京 100048;2．河北聯(lián)合大學(xué) 輕工學(xué)院，河北 唐山 063000)

微囊藻毒素分子印跡聚合物的制備及性能研究

申 晴1， 崔莉鳳1， 趙 碩2

(1．北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京 100048;2．河北聯(lián)合大學(xué) 輕工學(xué)院，河北 唐山 063000)

以微囊藻毒素MC-LR為模板，采用本體聚合法制備微囊藻毒素分子印跡聚合物，優(yōu)化制備過(guò)程．通過(guò)電子顯微鏡、孔隙度分析、紅外吸收等對(duì)其進(jìn)行表征，并研究其反應(yīng)機(jī)理和吸附性能．結(jié)果表明，單體∶模板∶交聯(lián)劑配比為0.9×106∶1∶1.2×106，洗脫時(shí)間25 min時(shí)為優(yōu)選條件，最大吸附量為153.7 μg/g，此分子印跡聚合物對(duì)MC-LR具有顯著的特異性吸附作用．

微囊藻毒素MC-LR;分子印跡聚合物;本體聚合;吸附性能

為了確保飲用水的安全健康，我國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838—2002)中對(duì)生活飲用地表水源地提出微囊藻毒素MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)為0.001 mg/L．微囊藻是藍(lán)藻水華中的優(yōu)勢(shì)藻，它能產(chǎn)生一類(lèi)環(huán)狀七肽結(jié)構(gòu)的微囊藻毒素(microcystins，MC)［1］．微囊藻毒素的種類(lèi)較多，目前發(fā)現(xiàn)有大約80種異構(gòu)體［2］，其中MC-LR是已知毒性最強(qiáng)、急性危害最大的一種淡水藻類(lèi)毒素，是最強(qiáng)的肝臟腫瘤促進(jìn)劑［3］．要確切地檢測(cè)微囊藻毒素及其異構(gòu)體，提高富集和分離技術(shù)是這方面的研究熱點(diǎn)．分子印跡技術(shù)是最近在分離領(lǐng)域中發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興技術(shù)［4］，而分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)以其卓越的識(shí)別性和選擇性，在環(huán)境、食品衛(wèi)生、醫(yī)藥化工等眾多領(lǐng)域顯示出較好的應(yīng)用前景［5］．如 Barahona等［6］合成噻苯咪唑分子印跡聚合物，用于固相萃取柑橘類(lèi)水果和橙汁樣品中的噻苯咪唑;De Barros等［7］利用分子印跡聚合物分離測(cè)定西紅柿中殺螟松的殘留量．方繼敏等［8］采用溶脹聚合法制備了微囊藻毒素分子印跡聚合物，對(duì)MC-LR具有良好的吸附能力，本體聚合法制備分子印跡聚合物與溶脹聚合法相比具有實(shí)驗(yàn)條件易于控制、制備工藝和設(shè)備簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用［9－10］．但至今沒(méi)有本體聚合法制備微囊藻毒素分子印跡聚合物的相關(guān)報(bào)導(dǎo)．

本文以MC-LR為印跡分子，采用本體聚合的方法，制備微囊藻毒素分子印跡聚合物材料，并對(duì)其反應(yīng)機(jī)理和吸附性能進(jìn)行分析．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與儀器

微囊藻毒素MC-LR標(biāo)準(zhǔn)樣品(E-LR-c100 microcystin LR≥95%by HPLC)，產(chǎn)地臺(tái)灣地區(qū);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，AR)，Sigma公司;2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸(AMPSA，AR)，AJohnson Matthey Company;偶氮二異丁腈(AIBN，CP)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲基二甲酯(DMP，AR)，北京化學(xué)試劑公司;二甲基亞砜(DMSO，AR)，西隴化工有限公司．

Wsters－1525型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司;Avatar 370型紅外光譜儀FTIR，尼高力公司;TESCANVEGAⅡ型掃描電子顯微鏡，捷克 TESCANS．R．O 公司;HJ－3型恒溫磁力攪拌器，金坊市至翔科技儀器廠(chǎng);ASAP2010M型比較面積與孔隙度分析儀，美國(guó)麥克儀器公司;KQ－400DB型數(shù)控超聲波發(fā)生器，昆山市超聲儀器有限公司．

1.2 微囊藻毒素分子印跡聚合物的制備

1.2.1 MIPs的制備

取 0.40 g 2-丙 烯 酰 胺-2-甲 基-1-丙 烷 磺 酸(AMSPA)、質(zhì)量濃度為1.12 μg/mL的 MC-LR 3.0 mL放入50.0 mL的安培瓶中，加入3.0 mL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩30 min后，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)0.003 g、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)4.0 mL，超聲混勻通入N2氣脫氧10 min后，真空密封，在70℃恒溫烘箱中反應(yīng)6 h，得到塊狀固體MIP，經(jīng)研磨、粉碎、過(guò)100目篩．

空白聚合物的制備除不加模板分子外，其他步驟相同．

1.2.2 印跡模板分子的洗脫

將所得粉末狀聚合物用1∶1的甲醇進(jìn)行淋洗，再用含0.1%三氟乙酸的甲醇溶液超聲振蕩洗脫，洗去模板分子．真空室溫干燥至質(zhì)量恒定后，即得到微囊藻毒素的分子印跡聚合物．空白印跡聚合物與印跡聚合物的洗脫方法相同．

1.3 分子印跡聚合物的表征

本實(shí)驗(yàn)采用掃描電子顯微鏡觀察聚合物的微觀形態(tài)，孔隙度分析儀來(lái)表征聚合物的孔徑分布情況，并用紅外光譜儀研究聚合物的結(jié)構(gòu)特征，用高效液相色譜法測(cè)定微囊藻毒素MC-LR的含量．

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的條件優(yōu)化

2.1.1 不同單體模板比例的選擇

選擇功能單體與模板的比例是制備MIPs的關(guān)鍵一步，二者的比例對(duì)識(shí)別孔穴的產(chǎn)生具有很大影響，所以實(shí)驗(yàn)取單體AMPSA與模板MC-LR的質(zhì)量比分別為 0.2 × 107∶1，0.7 × 107∶1，0.9 × 107∶1，1.3×107∶1和2.2 ×107∶1進(jìn)行聚合．通過(guò)聚合物的掃描電鏡圖及對(duì)藻毒素的吸附量，確定合成MIPs的最佳單體模板比例．掃描電鏡圖見(jiàn)圖1．

圖1 不同單體模板比例的MIPs掃描電鏡圖Fig．1 SEM for different monomers template proportion of MIPs

由圖1可以清晰地看出聚合物形態(tài)上的變化．單體與模板的比例較小時(shí)，形成的印跡點(diǎn)位不夠穩(wěn)定，過(guò)多的模板阻礙了單體間的聚合，很難形成聚合物．當(dāng)單體與模板的比例較大時(shí)，則單體之間容易直接聚合，產(chǎn)生分子包埋現(xiàn)象，質(zhì)量比AMPSA∶MC=0.9 ×107∶1時(shí)相對(duì)較好．

單體AMPSA與MC-LR的質(zhì)量比分別為0.2×107∶1，0.7 ×107∶1，0.9 ×107∶1，1.3 ×107∶1和2.2 ×107∶1時(shí)，制備的分子印跡聚合物對(duì)藻毒素的吸附量見(jiàn)圖2．由圖2可以看出，模板與單體質(zhì)量比為0.9×107∶1時(shí)吸附量也最大;所以，單體模板的比例AMPSA∶MC=0.9 ×107∶1時(shí)為佳．

圖2 不同單體模板比例的MIPs對(duì)藻毒素的吸附量Fig．2 Adsorption quantity of MC for different monomers template proportion of MIPs

2.1.2 不同交聯(lián)劑用量的選擇

交聯(lián)劑能使模板分子和功能單體形成高度交聯(lián)、剛性的聚合物，從而形成更加穩(wěn)定的印跡空穴．

不同交聯(lián)劑的使用對(duì)分子印跡聚合物形成的性質(zhì)有顯著的差異，見(jiàn)圖3．當(dāng)交聯(lián)劑用量較低時(shí)，生成的分子印跡聚合物網(wǎng)絡(luò)比較稀疏，交聯(lián)度較低，會(huì)使印跡空穴的穩(wěn)定性降低，吸附選擇性變差;增加交聯(lián)劑的用量時(shí)，則交聯(lián)度變大，交聯(lián)產(chǎn)物有一定強(qiáng)度，可使印跡空位得到較好的保持，有利于獲得高效的印跡聚合物．但交聯(lián)劑用量過(guò)高時(shí)，孔隙度降低，形態(tài)不規(guī)則，且尺寸分布不均勻，聚合物粘結(jié)在一起，不利于吸附及洗脫．所以交聯(lián)劑模板的比例為1.2 ×106∶1時(shí)為佳．

圖3 不同交聯(lián)劑用量的MIPs掃描電鏡圖Fig．3 SEM for different crosslinking agent amount of MIPs

2.1.3 洗脫時(shí)間的選擇

模板分子MC-LR可溶于甲醇，本實(shí)驗(yàn)分別用含0.1%三氟乙酸的甲醇來(lái)洗脫模板分子，這對(duì)其他反應(yīng)物并無(wú)影響．洗脫時(shí)間分別用 5，10，20，25，30，40 min．隨后，對(duì)洗脫液進(jìn)行液相色譜分析．當(dāng)洗脫時(shí)間為25 min時(shí)，液相色譜已無(wú)MC檢測(cè)出，所以洗脫時(shí)間選用25 min為佳，見(jiàn)圖4．

圖4 MC-LR的質(zhì)量濃度變化曲線(xiàn)Fig．4 Concentration change curve of MC eluent

2.2 合成分子印跡聚合物的優(yōu)化配方

通過(guò)討論影響分子印跡聚合物的表觀及內(nèi)在因素，在此基礎(chǔ)上確定合成MIPs的優(yōu)化配方，見(jiàn)表1．

表1 本體聚合法制備分子印跡聚合物的優(yōu)化配方Tab．1 Formulas for synthesis of MIPs by bulk polymerization

2.3 紅外吸收光譜圖解析

為證實(shí)模板分子MC-LR和功能單體AMPSA在引發(fā)劑AISN引發(fā)下的自組裝作用，本文通過(guò)紅外譜圖對(duì)比了含MC-LR的模板經(jīng)洗脫后和空白模板聚合物的情況，見(jiàn)圖5．

從圖5可以看出，空白模板和洗脫微囊藻毒素印跡后的模板，峰型基本一致，說(shuō)明印跡模板得到了較好的洗脫．在3 439.28 cm－1處為酰胺鍵中N—H的伸縮振動(dòng)峰，1 720.90 cm－1附近為較強(qiáng)的C==O伸縮振動(dòng)峰，表明經(jīng)交聯(lián)聚合得到的聚合物存在可以同印跡分子作用的酰胺基官能團(tuán)，在1 454.22 cm－1處的C==C雙鍵峰幾乎看不到，說(shuō)明具有C==C的大部分交聯(lián)劑和功能單體都已在聚合過(guò)程中消耗．

圖5 空白模板和印跡模板洗脫后的紅外吸收光譜圖Fig．5 IR spectroscopy of blank templates and imprinting template after eluting

2.4 聚合物的微孔結(jié)構(gòu)分析

所制得的MC-LR分子印跡聚合物是具有一定層次孔徑分布的多孔性聚合物，其孔徑范圍在3～86 nm，見(jiàn)圖6．其中孔徑小于20 nm的小孔占17.4%;20～50 nm的中孔占58.8%;孔徑50 nm以上的也有一定的分布，占總?cè)莘e的23.8%．這些大孔的存在為溶劑的擴(kuò)散提供了良好的空間，同時(shí)也是質(zhì)量交換的重要場(chǎng)所．

圖6 分子印跡聚合物的孔徑分布Fig．6 Pore diameter distribution curve of MIPs

2.5 分子印跡聚合物形成機(jī)理的探討

根據(jù)模板MC-LR和單體AMPA的分子結(jié)構(gòu)可以推測(cè):該作用可能是氫鍵和離子鍵作用．根據(jù)分子印跡聚合物的制備原理過(guò)程，推測(cè)出微囊藻毒素MC-LR分子印跡聚合物的形成如圖7．

圖7 分子印跡聚合物形成過(guò)程示意Fig．7 Formation process of MIPs

印跡聚合物中形成了與模板分子MC-LR相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，使印跡聚合物具有專(zhuān)一性、特異性識(shí)別等優(yōu)點(diǎn)．MC-LR上的羧羥基是良好的氫鍵供體，而2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸上的C==O、S==O基和C==C基均為氫鍵的受體，—CH2上的一對(duì)孤對(duì)電子可以與相鄰的C==O形成共軛，而C==O上的O原子上有兩對(duì)孤對(duì)電子，具有較高的電子云密度，因此，C==O基團(tuán)優(yōu)先于 MC-LR上的—OH、—NH2形成氫鍵．

2.6 分子印跡聚合物的吸附性能

為了檢驗(yàn)分子印跡的特異性吸附性能，其吸附是特異的分子印跡吸附而不是純物理吸附，本實(shí)驗(yàn)比較了在優(yōu)化條件下，分子印跡聚合物和空白印跡聚合物對(duì)不同濃度底物的吸附效果，如圖8．

圖8 有模板和空白模板分子印跡聚合物對(duì)模板分子的吸附量Fig．8 Adsorption capacities of template on MIPs and UMIPs

印跡聚合物吸附其模板分子MC-LR的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸附其同分異構(gòu)體MC-RR的能力(見(jiàn)表2)，此處對(duì)MC-RR的吸附可看做是物理吸附，這也說(shuō)明印跡聚合物對(duì)MC-LR的專(zhuān)一選擇性和特異識(shí)別性．分配系數(shù)是指洗脫模板后聚合物與空白模板聚合物的吸附量之比．

表2 有模板和空白模板分子印跡聚合物對(duì)不同底物的吸附效果Tab．2 Absorption effect of different sllbstrates on MIPs and UMIP

2.7 分子印跡聚合物的等溫吸附曲線(xiàn)及Scatchard模型分析

為了研究聚合物吸附性能的大小，在優(yōu)化條件下，即溫度25℃，吸附時(shí)間為150 min，分別取0.10 g聚合物經(jīng)洗脫、研磨、并過(guò)100目篩，然后放入5.0 mL各種不同濃度的MC-LR溶液中進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，等溫吸附曲線(xiàn)如圖9．在吸附過(guò)程中當(dāng)MC-LR濃度過(guò)低時(shí)，聚合物表面的功能基團(tuán)不能與印跡分子充分結(jié)合，平衡吸附量也較少．此時(shí)增加模板分子的濃度，則被功能基團(tuán)結(jié)合的印跡分子的數(shù)量就增多，相應(yīng)增加了產(chǎn)物表面的有效結(jié)合位點(diǎn)，從而增加其吸附性能．由圖9可知，當(dāng)吸附達(dá)到平衡時(shí)，最大吸附量為 153.7 μg/g．

圖9 分子印跡聚合物的等溫吸附曲線(xiàn)Fig．9 Isothermal adsorption curve of MIPs

Scatchard模型廣泛用于受體結(jié)合動(dòng)力學(xué)的研究．測(cè)定分子印跡聚合物在不同MC-LR濃度范圍內(nèi)的吸附量，并對(duì)該聚合物進(jìn)行Scatchard模型分析．Scatchard方程式如下:

式(1)中，Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)，Qmax為結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀吸附量．

將Q/Co對(duì)Q作圖(如圖10)，經(jīng)線(xiàn)性回歸，得回歸方程:y=－0.2355x+36.695，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，計(jì)算得離解常數(shù) Kd=4.2 μmol/L，最大表觀吸附量 Qmax=153.7 μg/g．

圖10 MC-LR在分子印跡聚合物上的Scatchard曲線(xiàn)Fig．10 Scatchard curve of MC-LR on MIPs

3 結(jié)論

以MC-LR為印跡分子，AMPSA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，二甲基亞砜為溶劑，制備了MCLR分子印跡聚合物，并優(yōu)化了聚合條件．并對(duì)分子印跡聚合物的機(jī)理進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)的研究．為地表水飲用水源地中微囊藻毒素MC-LR的富集分離、固相萃取和檢測(cè)提供了一種新方法．對(duì)于防范藻毒素給環(huán)境及人類(lèi)健康帶來(lái)的威脅，為飲用水安全保障提供技術(shù)支撐具有重要意義．

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(責(zé)任編輯:檀彩蓮)

Preparation and Performances of Molecularly Imprinted Polymer for Microcystins

SHEN Qing1， CUI Li-feng1， ZHAO Shuo2
(1．School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;2．Qinggong College，Hebei United University，Tangshan 063000，China)

The microcystins molecularly imprinted polymers(MIPs)were synthesized by bulk polymerization using microcystin(MC-LR)as the template，and the preparation process was optimized．The MIPs were characterized by electron microscopy，porosity analysis and FT-IR，and their reaction mechanism and adsorption performance were investigated．The results showed that the ratio of monomer，template，and crosslinking agent was 0.9 ×106∶1∶1.2 ×106，the adequate elution time was 25 min，and the maximum adsorption was 153.7 μg/g．The MIPs has a significant and specific adsorption to MC-LR．

microcystins MC-LR;molecularly imprinted polymers;bulk polymerization;adsorption performance

TS201.6

A

1671-1513(2012)03-0043-06

2011-10-21

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2102015)．

申 晴，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗h(huán)境分析;

崔莉鳳，女，教授，主要從事水環(huán)境問(wèn)題方面的研究．通訊作者．