冷 弘，盧 欣，劉慧濤，馬云云，王媛媛，馬 晶，郭茂峰，李 敏，趙國強(qiáng)#

1)洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室 洛陽 471000 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001 3)南陽油田總醫(yī)院消化腎病科南陽 473132 4)河南省職工醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州 451191

#通訊作者，男，1965年10月生，教授，研究方向:腫瘤病因?qū)W，E-mail:zhaogq@zzu.edu.cn

腸道病毒71型河南分離株2株全基因組序列分析*

冷 弘1)，盧 欣2)，劉慧濤3)，馬云云4)，王媛媛2)，馬 晶2)，郭茂峰2)，李 敏2)，趙國強(qiáng)2)#

1)洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室 洛陽 471000 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001 3)南陽油田總醫(yī)院消化腎病科南陽 473132 4)河南省職工醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州 451191

#通訊作者，男，1965年10月生，教授，研究方向:腫瘤病因?qū)W，E-mail:zhaogq@zzu.edu.cn

腸道病毒71型;手足口病;同源性分析;河南

目的:了解2011年河南洛陽和南陽地區(qū)流行的腸道病毒71型(EV71)基因特征。方法:分離洛陽和南陽地區(qū)EV71病毒各一株，分別進(jìn)行全基因測序和基因進(jìn)化分析。結(jié)果:EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011的VP1區(qū)序列在進(jìn)化樹上均屬于C4亞型，與國內(nèi)流行株都具有較高同源性，與2008年廣東流行株親緣關(guān)系最近。這2株全基因核苷酸序列同源性為99.3%，氨基酸序列同源性為97.6%，并且氨基酸均沒有發(fā)生明顯改變。結(jié)論: EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011屬于C4亞型，與我省及我國既往流行株相比，未發(fā)生大的變異。

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)［1-2］、柯薩奇病毒(Coxsackievirus A16，CoxA16)［3］等多種腸道病毒引起的常見傳染病，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征，重癥患者可表現(xiàn)為無菌性腦膜炎、腦炎等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾?。?］，多在嬰幼兒中流行，致殘和病死率均較高。近年來，世界各國包括亞太地區(qū)EV71流行日趨嚴(yán)重，呈逐年上升趨勢［5-8］，嚴(yán)重程度日趨增強(qiáng)［9-10］。我國于2008年5月將HFMD列為丙類傳染病。為了深入了解2011年河南省流行的EV71基因特征和積累分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，作者對2株EV71河南分離株進(jìn)行了全基因序列測定和進(jìn)化途徑分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 病毒RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司;RNA PCR(AMV)試劑盒、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司;pGEM-T Easy Vector Systems購自美國Promega公司;凝膠成像系統(tǒng)購自美國ABI公司。

1.2 EV71河南分離株的來源 選取2011年4月河南省洛陽市和南陽市、經(jīng)臨床確診為HFMD的患兒各1例，分別為1歲男嬰和2歲女幼兒，合并重癥心肌炎或肺炎。采集患兒咽拭子、糞便、皰疹液標(biāo)本，按WTO腸道病毒分離操作規(guī)程接種Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)，待產(chǎn)生細(xì)胞病變后，采用微量中和試驗(yàn)和RT-PCR方法鑒定，均為 EV71型，分別命名為EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011。

1.3 病毒cDNA的擴(kuò)增 將患兒皰疹液接種Vero細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生明顯細(xì)胞病變后，采用Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取RNA，分別用通用引物六聚體為引物，在AMV作用下逆轉(zhuǎn)錄后得到2個(gè)分離株的cDNA;以此為模板，在設(shè)計(jì)的覆蓋全基因組的8對引物(表1)作用下進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 EV71分段擴(kuò)增引物

1.4 擴(kuò)增片段的克隆和測序 使用Qiagen公司的DNA膠提取試劑盒回收 PCR產(chǎn)物;10×Buffer 1 μL，pGEM-T Easy Vector 1 μL，T4連接酶1 μL，膠回收DNA片段7 μL，室溫連接30 min，常規(guī)法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α;選擇白色轉(zhuǎn)化菌，培養(yǎng)后用Qiagen公司小量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司以T7和SP6為通用引物進(jìn)行測序。

1.5 病毒基因組序列分析 采用DNASTAR和DNASIS進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列同源性分析，利用Lasergene的MegAlign構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 全基因組擴(kuò)增結(jié)果 8對引物擴(kuò)增后均得到預(yù)計(jì)大小片段，見圖1。8個(gè)首尾相互重疊的克隆覆蓋了整個(gè)基因組。

圖1 8對引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 2株EV71全基因組測序結(jié)果 該研究中獲得的 EV71/Luoyang2011和 EV71/Nanyang2011核苷酸序列已提交 GenBank數(shù)據(jù)庫，編號(hào)分別為JN020147和JN052925。JN020147全基因組長度為7 405 bp，其中A占27.05%，G占23.94%，C占24.19%，U占24.82%;JN052925全基因組長度為7 404 bp，其中 A占26.99%，G占24.80%，C占24.22%，U占24.82%;兩者均A和U豐富。兩者核苷酸序列除3’末端非編碼區(qū)(3’UTR)外，全部一致(表2)，5’UTR均含有742 bp，隨后為6 582 bp的編碼區(qū)，編碼一個(gè)2 193氨基酸的多聚蛋白，最后3’UTR分別含84 bp(JN020147)或83 bp(JN052925)。

表2 2株EV71病毒基因組編碼區(qū)核苷酸及氨基酸數(shù)目

2.3 2株病毒基因組核苷酸序列同源性分析結(jié)果見表3和表4。JN020147全基因序列與阜陽流行株(EU703814)同源性最高，與湖北流行株(6U 434678)同源性最低;在5’UTR區(qū)與挪威流行株(DQ452074)同源性最低，在P3區(qū)與挪威流行株(DQ452074)和臺(tái)灣流行株(DQ060149)同源性最低;在3’UTR區(qū)與阜陽(HQ188292、EU703814)及上海流行株(HQ891929)同源性最高，與新加坡流行株(AF352027)同源性最低。

JN052925全基因序列與阜陽流行株(EU703814)同源性最高，與湖 北流行株(GU434678)同源性最低;在5’UTR區(qū)與廣東流行株(FJ194965)同源性最高，與挪威流行株(DQ452074)同源性最低;在 3’UTR區(qū)與阜陽(HQ188292、EU703814)、上海流行株(HQ891929)同源性最高(100%)，與新加坡流行株(AF352027)同源性最低。

JN020147和 JN052925全基因序列同源性為99.3%，在VP1區(qū)同源性為99.0%，在3’UTR區(qū)核苷酸序列完全相同。

2.4 2株病毒基因組氨基酸序列同源性分析結(jié)果見表5。JN020147編碼區(qū)氨基酸序列與大部分EV71同源性都較高，與 COXB3同源性最低，與COXA16同源性中等;在結(jié)構(gòu)蛋白P1區(qū)(包括VP1、VP2、VP3、VP4)也與大部分EV71同源性較高，其中VP4區(qū)與大部分病毒同源性均為100%，與COXB3同源性最低，與COXA16同源性中等;在非結(jié)構(gòu)蛋白P2和P3區(qū)，與COXA16同源性較高。

JN052925基因組氨基酸序列同源性結(jié)果與JN020147株類似，除編碼區(qū)及P3區(qū)外，在其他區(qū)氨基酸序列同源性與JN020147完全相同。

JN020147和JN052925基因組氨基酸序列同源性為97.6%，在P3區(qū)為99.7%，在其他區(qū)同源性均為100%。

表3 JN020147與其他毒株核苷酸序列同源性的比較 %

表4 JN052925與其他毒株核苷酸序列同源性的比較 %

表5 JN020147及與JN052925其他毒株氨基酸序列同源性的比較 %

2.5 2株病毒基因遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)病毒全基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹見圖2?？梢钥闯觯琂N020147和JN052925與以往國內(nèi)EV71病毒C4型分離株遺傳距離較近，與EV71病毒A型湖北分離株(GU434678)及COX A16型及B3、B4、B5型遺傳距離較遠(yuǎn)，與核苷酸同源性比較結(jié)果一致。

圖2 核酸進(jìn)化樹

3 討論

自2008年以來，EV71感染在我國呈暴發(fā)狀態(tài)，并出現(xiàn)多例死亡病例。河南省 2010年共報(bào)告HFMD 96 815例，其中重癥患者8 934例，死亡48例，重癥發(fā)病率高于全國平均水平。

該研究中的2株EV71毒株分別采自河南洛陽和南陽的確診病例，這2株VP1區(qū)核苷酸序列同源性高達(dá)99.0%，氨基酸序列除基因組編碼區(qū)和P3區(qū)外，同源性均為100%，說明這2株均為河南省本地株，基因在流行中有所變化，但多為無義突變，編碼蛋白質(zhì)無明顯變化。這2株與EV71/A型的湖北流行株(GU434678)［11］同源性低，而與其他C4型國內(nèi)流行株均具有較高同源性(93.1%～99.3%，92.9%～99.0%)，在遺傳進(jìn)化樹上與EV71的C4亞型遺傳距離較近，說明這2個(gè)分離株均為EV71的C4亞型，并提示EV71病毒株目前相對穩(wěn)定，沒有發(fā)生大的變異。這2個(gè)毒株的VP1區(qū)都與廣東流行株(FJ194965)同源性最高，原因可能為:河南為勞動(dòng)力輸出大省，每年有大量人口輸出至廣東，且鄭州為全國交通樞紐，兩地人口往來頻密，病毒可在兩地間快速傳播。該研究中的2個(gè)分離株與以往分離到的3株河南EV71毒株的同源性較高，說明該C4亞型毒株在河南省可能仍有廣泛的分布和傳播。這2株的5’UTR區(qū)、VP1區(qū)和全基因序列與我國目前分離到的EV71毒株無明顯差異，毒力也沒有發(fā)生顯著變化。

總之，該研究對2011年河南洛陽和南陽兩地區(qū)分離的EV71進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，為該病毒的基礎(chǔ)研究及疫苗研制奠定了基礎(chǔ)，并為制定相應(yīng)的EV71防御策略提供了重要的參考價(jià)值。

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Analysis of complete genome sequence of two enterovirus 71 strains isolated from Henan

LENG Hong1)，LU Xin2)，LIU Huitao3)，MA Yunyun4)，WANG Yuanyuan2)，MA Jing2)，GUO Maofeng2)，LI Min2)，ZHAO Guoqiang2)1)Department of Immunology and Pathogen Biology，Luoyang Vocational＆Technical College，Luoyang 471000 2)Department of Microbiology and Immunology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou U-niversity，Zhengzhou 450001 3)Department of Gastroenterology and Nephrology，Nanyang Oilfield General Hospital，Nanyang 473132 4)Department of Microbiology and Immunology，Henan Medical College for Staff and Workers，Zhengzhou 451191

enterovirus71;hand-foot-and-mouth disease;homology analysis;Henan province

Aim:To analyze the genome of two enterovirus 71 isolated strains obtained from Luoyang and Nanyang in Henan province in 2011.Methods:Two enterovirus 71 isolated strains from Luoyang and Nanyang，respectively，was obtained and the complete genome sequence and phylogenetic analysis were analyzed.Results:The nucleotide sequence of VP-1 regions in EV71/Luoyang2011 and EV71/Nanyang2011 should be classified phylogenetically as subtype C4，which were mostly close to Guangdong Strain in 2008，and shared higher sequence homology with other domestic EV71 strains of China.They were similar to each other，and nucleotide and amino acid sequence identities were 99.3%and 97.6%，respectively.The amino acid sequence identities of them had hardly variation.Conclusion:EV71/Luoyang2011 and EV71/ Nanyang2011 belong to subtype C4，and have little variation with other former EV71 strains in China.

R373.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.02.0010

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目 200902006

(2011-07-07收稿 責(zé)任編輯王 曼)