齊 玲，李蘊(yùn)潛，金 宏，丁麗娟，于洪泉，溫 娜，劉 威

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春130021；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林132013）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)特性

齊 玲1，李蘊(yùn)潛2，金 宏3，丁麗娟2，于洪泉2，溫 娜3，劉 威3

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春130021；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林132013）

目的：從人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SC 326和SC 189細(xì)胞株分離培養(yǎng)干細(xì)胞，研究其自我更新、增殖和分化等生物學(xué)特性。方法：用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SC 326和SC 189細(xì)胞，檢測細(xì)胞形成神經(jīng)球的能力。對培養(yǎng)3代以上的細(xì)胞（GSC）進(jìn)行神經(jīng)球細(xì)胞單細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)；用第3代和第7代的細(xì)胞評價神經(jīng)球單細(xì)胞克隆形成率；免疫熒光染色法檢測神經(jīng)球細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)及多向分化能力。結(jié)果：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h時SC 326、SC 189形成神經(jīng)球樣細(xì)胞團(tuán)，1周時神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞可達(dá)數(shù)百個，3代內(nèi)神經(jīng)球細(xì)胞SC 326的增殖率為（2.10±4.33）%、（4.03±4.14）%和（6.91±5.12）%，SC 189為（12.79±2.32）%、（15.78±3.25）%和（37.91±4.58）%；單細(xì)胞克隆形成率 GSC 326和 GSC 189分別為5.56%和8.33%，次級單細(xì)胞克隆形成率分別為9.89%和14.58%；GSC 326 P3和P7神經(jīng)球克隆形成率最大值為（12.67±2.86）%和（20.44±1.73）%，GSC 189 P3和P7神經(jīng)球克隆形成率最大值為（32.00±1.00）%和（42.67±5.03）%。免疫熒光染色，干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133和神經(jīng)巢蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，分化標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和神經(jīng)元特異性類β－微管蛋白Ⅲ（β－TubulinⅢ）表達(dá)極弱。分化誘導(dǎo)后分化標(biāo)記物GFAP和β－TubulinⅢ的表達(dá)呈陽性。結(jié)論：早期原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中存在少量具有自我更新、增殖和多向分化能力的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞特性。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞；自我更新；增殖；分化

腦腫瘤以膠質(zhì)瘤最為常見，70%以上膠質(zhì)瘤為惡性，以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性度最高。尋找腦腫瘤復(fù)發(fā)的根源，延長患者的生存時間，已成為亟待解決的難題。越來越多的研究［1－3］顯示：腦腫瘤干細(xì)胞可能是腦腫瘤復(fù)發(fā)及治療抵抗的根源。國內(nèi)外相關(guān)研究［4－5］顯示：由于腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)本來源少，難以培養(yǎng)，不易獲得足夠的研究材料，這給腦腫瘤干細(xì)胞的研究帶來了一定困難。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用早期原代（3代以內(nèi)）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SC 326和SC 189細(xì)胞株［6］，用無血清培養(yǎng)基（serum－free media，SFM）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3代后對其干細(xì)胞特性進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 本實(shí)驗(yàn)室保存膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SC 326和SC 189細(xì)胞株［6］。DMEM／F12培養(yǎng)液、神經(jīng)培養(yǎng)基、B27添加劑和小牛血清（美國Gibco公司）；人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（b FGF，英國Pepro Tech公司）；人表皮生長因子（EGF，英國Pepro Tech公司）；兔抗人CD133多克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；鼠抗人Nestin單克隆抗體、鼠抗人β－TubulinⅢ單克隆抗體和兔抗人GFAP多克隆抗體（加拿大Inc公司）；Tex－Red標(biāo)記驢抗鼠和FITC標(biāo)記驢抗兔IgG抗體（美國Jachson Immunoresearch公司）。

1.2 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤神經(jīng)球的培養(yǎng) 將SC 326和SC 189細(xì)胞以104cm－2的密度接種到SFM（神經(jīng)培養(yǎng)基含有EGF 20μg·L－1、bFGF 20μg·L－1、1×B27添加物）中，置于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。每天觀察生長情況，5～7 d后收集無血清培養(yǎng)基的懸浮神經(jīng)球，110 g離心10 min后換新鮮SFM，機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2或1∶3比例傳代，3代以后細(xì)胞命名為GSC 326、GSC 189。

1.3 單細(xì)胞懸液的制備及單細(xì)胞克隆形成率的測定 將GSC 326、GSC 189神經(jīng)球細(xì)胞機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，300目濾網(wǎng)過濾，臺盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞。細(xì)胞梯度稀釋到10 m L－1濃度，在96孔板每孔中加入100μL細(xì)胞懸液，6 h后顯微鏡下觀察孔中的細(xì)胞數(shù)目，記錄含單細(xì)胞的孔。1個月后計數(shù)單細(xì)胞克隆形成率。神經(jīng)球長至100～200個細(xì)胞后，將克隆球連同培養(yǎng)液吸出，機(jī)械吹打成單細(xì)胞后接種于96孔板中，繼續(xù)觀察次級克隆形成率，單細(xì)胞或次級克隆形成率＝含神經(jīng)球孔／含細(xì)胞孔×100%。

1.4 神經(jīng)球干細(xì)胞表面抗原的檢測 收集神經(jīng)球，800 g離心3 min，棄上清。PBS洗滌沉淀轉(zhuǎn)至1.5 m L離心管中，4% 多聚甲 醛 固 定。0.3%Triton X－100通透細(xì)胞。5%驢血清室溫封閉1 h，加 入 一 抗（Nestin 1，200；CD1331，100；β－TubulinⅢ1，200；GFAP 1∶1000）4℃過夜，加入相應(yīng)的二抗（Tex－Red或FITC 1∶200），室溫下避光孵育1 h。用DAPI染色試劑盒進(jìn)行核染色并封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 神經(jīng)球誘導(dǎo)分化后多分化潛能的檢測 將GSC 326和GSC 189神經(jīng)球制備成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104的密度接種于已放入玻片的6孔板中，誘導(dǎo)分化14 d。取出玻片，PBS沖洗2次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次；0.3%Triton X－100通透15 min，PBS沖洗2次。5%驢血清封閉30 min。加入一抗4℃過夜。PBS沖洗2次。加入相應(yīng)二抗，室溫黑暗條件下孵育1 h。PBS沖 洗2次。4′，6－二 脒 基－2－苯 基 吲 哚（4′，6－diamidino －2－phenylindole，DAPI） 染 色 封 片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組取2張作陰性對照，分別不加一抗和不加一抗及二抗，以PBS代替。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。神經(jīng)球細(xì)胞增殖能力和神經(jīng)球單細(xì)胞克隆形式率以±s表示，第3和7代神經(jīng)球單細(xì)胞克隆形成率比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在SFM中形成神經(jīng)球的能力SC 326和SC 189細(xì)胞轉(zhuǎn)入SFM中培養(yǎng)，6 h后細(xì)胞從伸展?fàn)顟B(tài)開展縮小、變圓。24 h細(xì)胞變亮呈球形，增生形成神經(jīng)球樣細(xì)胞團(tuán)。3 d后神經(jīng)球明顯增多、增大，形狀多規(guī)則，由數(shù)量不等的圓形細(xì)胞組成。1周后神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞可達(dá)到數(shù)百個，晃動培養(yǎng)瓶時可見神經(jīng)球滾動。臺盼蘭計數(shù)細(xì)胞后，計算1至3代傳代形成神經(jīng)球細(xì)胞的增殖率，SC 326細(xì)胞為（2.10±4.33）%、（4.03±4.14）%和（6.91±5.12）%，SC 189 細(xì) 胞 為（12.79±2.32）%、（15.78±3.25）%和（37.91±4.58）%。見圖1。

圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在SFM中形成神經(jīng)球的過程Fig.1 The process of neuroshpere formation from glioblastoma cells in SFM

2.2 神經(jīng)球單細(xì)胞克隆形成率 觀察96孔板中細(xì)胞，接種24 h時細(xì)胞明顯增大、腫脹和變亮，約7 d時可見到明顯的細(xì)胞分裂增殖，2周時已形成有數(shù)十個細(xì)胞的神經(jīng)球，1個月后GSC 326和GSC 189單細(xì)胞克隆形成率分別為5.56%和8.33%。將神經(jīng)球再消化成單細(xì)胞，GSC 326和GSC 189次級單細(xì)胞克隆形成率分別為9.89%和14.58%。見圖2。

2.3 第3和7代神經(jīng)球單細(xì)胞克隆形成率 將每孔200個神經(jīng)球細(xì)胞按1∶2密度梯度稀釋方法接種于96孔板中。24 h后P3和P7均出現(xiàn)部分細(xì)胞明顯增大、腫脹、變亮和細(xì)胞增殖緩慢，不同的是第7代神經(jīng)球比第3代形成次級神經(jīng)球速度快，并且形成更大的次級神經(jīng)球；GSC 189較GSC 326形成神經(jīng)球的速度快，且神經(jīng)球的體積更大。2周后計算克隆形成率GSC 326 P3和P7最大值分別為（12.67 ± 2.86）% 和（20.44 ± 1.73）%，GSC189 P3和P7最大值分別為（32.00±1.00）%和（42.67±5.03）%，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 GSC 326和GSC 189單細(xì)胞克隆形態(tài)Fig.2 The morphology of neurosphere formation of GSC 326 and GSC 189 single cells

圖3 不同代神經(jīng)球次級克隆形成率Fig.3 The sub－clone formation rates of different passages of neurospheres

2.4 神經(jīng)球干細(xì)胞表面抗原特異性標(biāo)記物的表達(dá)

神經(jīng)球干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和巢蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性；分化標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經(jīng)元特異性類β－微管蛋白Ⅲ（neuron－specific classβ－TubulinⅢ，β－TubulinⅢ）表達(dá)較弱。見圖4（封二）。

2.5 神經(jīng)球經(jīng)分化誘導(dǎo)后分化標(biāo)記物的表達(dá) 在最初幾天可見到神經(jīng)球開始分散伸展，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不同的變化，第7天時觀察到有明顯的神經(jīng)元出現(xiàn)，隨著時間的延長出現(xiàn)更多的神經(jīng)元。熒光抗體標(biāo)記后，第7天時神經(jīng)元特異性抗體表達(dá)不明顯，在2周時表達(dá)明顯增加；GFAP表達(dá)較多，隨著分化時間的延長表達(dá)量也增加。見圖5（封二）。

3 討 論

在人體各部位的腫瘤中，腦腫瘤對生命的威脅較大，對生活質(zhì)量的影響也更明顯。最近腫瘤生物學(xué)研究［1］顯示：腫瘤的生長和更新是由一小群腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cells，TSCs）所驅(qū)動。因此，腦腫瘤中存在 “腦腫瘤干細(xì)胞（brain tumor stem cells，BTSCs）”，其是腦腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)的根源，并使腫瘤對放、化療等產(chǎn)生抵抗［1－3］。

1992年Reynolds等［7］建立了神經(jīng)球分離神經(jīng)干細(xì)胞的方法。神經(jīng)球由干細(xì)胞、祖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞組成，在神經(jīng)球中僅有10%～50%的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，在傳代過程中，終末分化細(xì)胞很快死亡，干細(xì)胞增殖并具有再形成神經(jīng)球的能力，且這個過程可以重復(fù)出現(xiàn)。這樣在培養(yǎng)體系中存在大量、穩(wěn)定的神經(jīng)干細(xì)胞［8－10］。針對這一特性，本研究選用3代以內(nèi)的SC 326和SC 189細(xì)胞，將細(xì)胞接種至SFM中培養(yǎng)［11］，大部分細(xì)胞死亡，有少量細(xì)胞增大、變圓和變亮，開始增生，形成神經(jīng)球。最初形成的神經(jīng)球數(shù)量很少，但在傳代過程中神經(jīng)球數(shù)量逐漸增多。本研究還發(fā)現(xiàn)：SC 189較SC 326更易形成神經(jīng)球，形成神經(jīng)球的數(shù)量明顯增多。

腫瘤干細(xì)胞在SFM中呈懸浮球狀生長，具有無限增殖、自我更新和多向分化的特性［7］。本文作者通過膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在SFM中形成神經(jīng)球的能力、單細(xì)胞克隆形成率、次級單細(xì)胞克隆形成率和不同代神經(jīng)球單細(xì)胞克隆形成率的比較發(fā)現(xiàn)：所獲得的GSC 326、GSC 189神經(jīng)球細(xì)胞具有明顯的增殖能力，并且具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞所占比例極小。在神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物中CD133和巢蛋白應(yīng)用較多［12－14］，這些標(biāo)記物也同樣應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞的檢測中。本研究中免疫熒光檢測GSC 326和GSC 189神經(jīng)球表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和巢蛋白，顯示神經(jīng)球干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)呈強(qiáng)陽性；同時分化標(biāo)記物β－TubulinⅢ和GFAP表達(dá)極弱。腦腫瘤干細(xì)胞除了需要鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)記外，由于其具有多向分化潛能，可以誘導(dǎo)分化為多種終末分化細(xì)胞，故還需進(jìn)行分化標(biāo)記物的鑒定。腦腫瘤干細(xì)胞主要分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞［15］。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白有Neu N、Map2和β－TubulinⅢ。有研究還檢測到樹突狀細(xì)胞的標(biāo)記蛋白有Olig－2、O4和S－100β。本實(shí)驗(yàn)選取GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記物，β－TubulinⅢ作為神經(jīng)細(xì)胞的分化標(biāo)記物。本研究對GSC 326、GSC 189神經(jīng)球細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)后，免疫熒光染色結(jié)果顯示：2株神經(jīng)球細(xì)胞均可誘導(dǎo)出典型分化細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元），分化標(biāo)記物染色陽性。

從患者腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本分離培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)條件比較特殊，培養(yǎng)液組成復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，給膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究帶來了很多不便。從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株原代培養(yǎng)細(xì)胞中篩選干細(xì)胞，使腦腫瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)更加簡便快捷，不受實(shí)驗(yàn)室條件的影響，但還需要繼續(xù)研究其培養(yǎng)的條件，簡化培養(yǎng)基組成成分。

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Isolation and culture of glioblastoma stem cells and their biological characteristics

QI Ling1，LI Yun－qian2，JIN Hong3，DING Li－juan2，YU Hong－quan2，WEN Na3，LIU Wei3
（1.Department of Pathology，Jilin Medical College，Jilin 132013，China；2.Department of Neurosurgery，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Experimental Center，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Objective To isolate and culture the stem cells from human glioblastoma SC 326 and SC 189 cells and to investigate the biological characteristics such as self－renewal，proliferation，and differentiation.Methods The human glioblastoma SC 326 and SC 189 cells were cultured in serum－free media，the capability of forming neurospheres was detected.Clone forming rate assay was performed to assess the capacity of self－renewal and clonogenic potential of the cells.Immunofluorescence staining method was used to study the expressions of surface markers of stem cells and the multi－differentiation function of neurospheres.Results The cells isolated from SC 326 and SC 189 cultured in serum－free media for 24 h had strong characteristics of self－renewal，proliferation，and neurosphere reformation.The proliferation rates of SC 326 were（2.10±4.33）%，（4.03±4.14）%，and（6.91±5.12）%；and those of SC 189 were（12.79±2.32）%，（15.78±3.25）%，and（37.91±4.58）%in the first three generations；the rates of neurospheres formation of GSC 326 and GSC 189 single cells were 5.56%and 8.33%，and the rates of sub－spheres formation were 9.89%and 14.58%；the maximum clone formation rates of GSC 326 P3 and P7 neurospheres were（12.67±2.86）%and（20.44±1.73）%，and those of GSC 189 P3 and P7 were（32.00±1.00）%and（42.67±5.03）%.Immunofluorescence staining showed that the neuron stem cells marker CD133 and nestin positively expressed；and the glial fibrillary acidic protein（GFAP）and neuron－specific classβ－tubulinⅢ（β－Tubulin Ⅲ）weekly expressed.After treated with differentiated media，the expressions of differentiation markersβ－Tubulin Ⅲ and GFAP were positive.Conclusion A few cells existed in glioblastoma SC 326 and SC 189 cell lines in the primary and early stage have the capacities of self－renewal，proliferation and multi－differentiation and the cells present definite features of stem cells.

glioblastoma stem cells；self－renewal；proliferation；differentiation

R739.41；Q813

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1043－05

2012－06－11

國家自然科學(xué)基金青年基金資助課題（81201671）；吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題（202015242）；吉林省教育廳 “十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助課題（2012330）

齊 玲（1974－），女，吉林省吉林市人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腦腫瘤干細(xì)胞方面的研究。

齊 玲（Tel：0432－64560027，E－mail：qiling1718＠163.com）

時間：2012－10－2509：34

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20121025.0934.004.html