Paul I Terasaki

翻譯：周永昌

體液免疫理論強調(diào)抗體是移植排斥的主要原因。該理論的發(fā)展和確定伴隨著歷史上大量的無可爭辯的證據(jù)。然而，像所有的歷史一樣，對證據(jù)的判定、闡述和結(jié)論無法避免主觀的影響。這也是為什么接受體液免疫理論的人還在不斷地探索并報道令人信服的證據(jù)和結(jié)論。

需要提醒的是，體液免疫理論的歷史從未包括細胞方面的免疫反應(yīng)。理由是不管細胞免疫多重要，其與體液免疫理論的發(fā)展關(guān)系并不緊密。移植物排斥是個復雜的過程，涉及諸多因素。筆者在這里強調(diào)抗體的作用是因為抗體極可能是引發(fā)其他連鎖反應(yīng)的關(guān)鍵因素，包括激發(fā)細胞免疫反應(yīng)。8年前，筆者在綜述體液免疫理論時曾呼吁堅持細胞免疫理論的人也能夠?qū)?篇細胞免疫理論的綜述。如果大量的證據(jù)支持細胞免疫理論，該理論應(yīng)該得到論證及確定。

另一個值得提醒的地方是，Medawar明確支持細胞免疫理論。很多人認為，支持體液免疫理論是對Medawar本人的抨擊。50年前，筆者是Medawar的學生，為此深感榮幸。筆者至今仍認為，當初在Medawar實驗室工作時獲得的激勵和鞭策對筆者整個事業(yè)的影響是巨大的。筆者相信，如果Medawar活在今日，他對細胞免疫的觀點一定會有改變。

科學的進步不會一帆風順，需要一步一步地前進，但每一步前進或每一個突破都是基于新觀念或新技術(shù)的引進，每一步前進都是巨大的。例如，成千上萬的論文和無數(shù)問題的解決基于的是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)的引進，相比之下，器官移植體液免疫理論的發(fā)展基于很多小的前進步伐，歷經(jīng)100年的探索，其進展可分為3個階段，每個階段大約40～50年。1900年，Landsteiner發(fā)現(xiàn)了紅細胞ABO系統(tǒng)，但該系統(tǒng)不是與器官移植相關(guān)的組織相容系統(tǒng)，所以器官移植體液免疫理論發(fā)展的第一步應(yīng)該是1914年染料排除試驗的建立，該檢測方法可在體外鑒定細胞的存活或死亡，從而可鑒定出細胞毒抗體。第二步發(fā)生在50年后的微量淋巴毒檢測方法的建立，該方法至今仍在應(yīng)用，只是在配型方面，分子生物學方法已成為主要的檢測手段。這個階段經(jīng)歷了40年，直到幾年前單一抗原微珠方法的建立，該技術(shù)通過重組細胞株獲得純化的抗原。人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA)系統(tǒng)的多態(tài)性表現(xiàn)在眾多不同的抗原/抗體特異性。單一純化抗原可確定單一抗體的特異性，從而使監(jiān)測移植后抗體的出現(xiàn)，尤其是針對供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA)，成為可能。以下是對體液免疫理論發(fā)展三個歷程的具體描述。

一、染料排除實驗

Pappenheimer[1]首次報告錐蟲藍（Trypan Blue）排除實驗，即被抗體和補體破壞的細胞被染為藍色，而沒有被染色的細胞為活細胞。目前檢測抗體的技術(shù)仍參考這樣相對簡單的方法。1913年到1929年期間，腫瘤免疫方面的研究主要集中在提高機體對腫瘤的免疫力，為此錐蟲藍染色或曙紅染色實驗被普遍應(yīng)用，以確定腫瘤細胞是否被抗體消滅[2]。

1929年，Woglom[3]綜述了自1913年以來發(fā)表的有關(guān)移植腫瘤的600篇學術(shù)論文。例如，將大鼠肉瘤移植到豚鼠身上會導致豚鼠對大鼠肉瘤的免疫排斥，但大鼠的皮膚和血液同樣具有免疫原性，由此提示，豚鼠產(chǎn)生的免疫性并非針對肉瘤，而是針對大鼠組織[4]。Ruo和Murphy[5]發(fā)現(xiàn)，來自雞魯斯肉瘤致敏的鵝血清，其表現(xiàn)的免疫性不同于對細胞的免疫性。后來發(fā)現(xiàn)，對腫瘤的作用實際上來自一種病毒，既魯斯肉瘤病毒[5]。眾多的類似研究，希望動物體內(nèi)產(chǎn)生抗腫瘤抗體，但其結(jié)果使科研人員最終認識到，移植腫瘤確實可產(chǎn)生抗體，包括同源或非同源，但其免疫性并不是針對腫瘤本身。也就是說，機體排斥的不是腫瘤，而是移植物的組織，長期以來探索的腫瘤免疫實際上僅是對移植抗原的免疫。盡管結(jié)果令人沮喪，但可明確地證實抗體導致移植物排斥。

為了解決腫瘤特異性的問題，20世紀30和40年代，人們建立了小鼠的純系株。Gorer和Schutze[6]通過純系鼠發(fā)現(xiàn)了小鼠的H-2組織相容位點，針對A系小鼠的兔血清抗體不能與C57/bl小鼠發(fā)生反應(yīng)，這是一項重大的突破。他們進一步證實，機體對腫瘤的反應(yīng)受抗原類別的影響，而抗原類別可通過抗血清（血清抗體）得以確定。此后，Snell[7]通過移植腫瘤確定了小鼠的，由他起名的組織相容位點（H-2）。這一歷史性的發(fā)現(xiàn)使他獲得了諾貝爾獎。如果Gorer沒有去世的話，非?？赡芩麜窒磉@一殊榮。

自1950年，筆者開始研究針對移植的Brown-Pearce兔腫瘤細胞的同種異體抗體。1953年，Kalfayan和Kidd[8]發(fā)表了類似的研究結(jié)果。筆者覺得，他們的研究做得比筆者好。在證明移植抗原時，紅細胞凝聚抗體很有幫助[9]，細胞毒抗體也在Gorer和Amos[10]的淋巴瘤研究中得到描述。移植抗體的檢測技術(shù)和方法受到了重視，有關(guān)這方面的論述來自3篇重要的文獻，每篇間隔1年[11-13]。結(jié)論是紅細胞凝聚試驗實際上檢測的是同一的抗體。Amos等[14]在皮膚移植的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗體的存在。隨后，皮膚移植的雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有淋巴細胞凝聚素[15]以及皮膚移植的兔體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有細胞毒抗體[16]。此外，補體在免疫反應(yīng)中的作用也受到了重視[17]，然而問題仍然存在，即這些抗體是否在體內(nèi)攻擊移植物。

對這一問題最令人信服的答案可參考Stetson和Demopoulos[18]在等1958年發(fā)表的論文。他們證實，將同種異體抗體注射到小鼠體內(nèi)，移植的皮膚顏色轉(zhuǎn)為蒼白。此后，筆者實驗室的研究表明，將同種異體抗體注射到小鼠的腎動脈里可導致腎臟失去功能[19]。當時用的檢測方法是攝取鄰碘馬尿酸鈉，但由于當時技術(shù)上的原因，抗體注射后不能有效止血，一些注射正常血清的小鼠腎臟也出現(xiàn)功能受損。

1958年，在血庫工作的Dausset[20]發(fā)現(xiàn),接受多次輸血的患者可產(chǎn)生抗白細胞抗體。Dausset作為第一個發(fā)現(xiàn)HLA而獲得諾貝爾獎。此后，其他血庫的科研人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不同的HLA。荷蘭的van Rood等[21]開始用白細胞凝聚實驗確定HLA；美國斯坦福大學的Payne和Rolfs[22]開始研究妊娠血清，并發(fā)現(xiàn)妊娠血清中存在由胎兒刺激產(chǎn)生的HLA抗體，因胎兒的HLA與母親的HLA不具相容性。

二、微量淋巴細胞毒檢測

直至1964年，越來越多的研究機構(gòu)開始研究人類組織相容性，由此促成了第一屆國際組織相容研討會。Bernard Amos出任大會主席，地點在美國的杜克[25]。大會的主要議題是哪種方法是檢測HLA的最好方法。當時，白細胞凝聚試驗最為普遍，在會上介紹了微量淋巴細胞毒實驗方法。該方法只用1μl試劑和同樣微量的淋巴細胞。為了更快，更精確地確定HLA抗原，并報告給國際組織相容研討會，各實驗室間開始了血清交換及比較。由于微量淋巴細胞毒方法可使1ml血清檢測1000個標本或1000次試驗，避免了大量血清的流失。1970至1984年間的國際組織相容研討會報道了諸多新的抗原。

Ceppellini等[27]在1967年第3屆國際組織相容研討會上報道，所有觀察到的抗原抗體反應(yīng)均涉及到一個共同的遺傳基因位點，該結(jié)論受到了高度的評價。1968年，世界衛(wèi)生組織召開了第一次對新抗原的命名會議，命名這個基因位點為HLA。這個新位點的命名基于對抗體 （直接針對移植抗原的抗體）的認識。此種抗體來自于人與人之間的免疫反應(yīng)，因此HLA抗原的發(fā)現(xiàn)直接源于體液免疫理論。

通過微量細胞毒檢測方法，筆者報道了第1例抗體介導的腎移植急性排斥病例[28]。之后，Kissmeyer-Nielson等[29]根據(jù)白細胞凝聚實驗方法報道了兩例他們稱為腎移植“超急排斥”的病例。因為當時交叉配型試驗尚未開始應(yīng)用，出現(xiàn)超急排斥的病例很多。筆者對初始報道的30例急性排斥進行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)24例（80﹪）患者交叉配型結(jié)果為陽性[30]，Starzl等[31]和Williams等[32]隨后將此種排斥歸類于超急排斥。這些臨床觀察首次提出了令人信服的證據(jù)，即抗體可在移植后數(shù)分鐘內(nèi)將移植物排斥掉。

體液免疫的理論推斷為：如果抗體導致移植物排斥，排斥發(fā)生后應(yīng)該能檢測到抗體。Morris等[33]在1968年首次報道了腎移植排斥前后存在抗體。當時，Morris往返于Richmond和筆者的實驗室，研究腎移植排斥與抗體的關(guān)系。筆者發(fā)現(xiàn)，這些導致排斥的抗體為DSA[34]。Jeannet等[35]在1970年報道了同樣的發(fā)現(xiàn)。

之后的證據(jù)進一步表明，術(shù)前存在抗體的腎移植患者可發(fā)生急性排斥，即排斥發(fā)生在移植后4個月內(nèi)[36]。隨后的40年，大量的臨床數(shù)據(jù)反復驗證了抗體與早期排斥的關(guān)系。目前，只要腎移植患者術(shù)前存在HLA抗體，就會被注明“高危險”。所有這些均基于細胞毒檢測，但該方法正在逐漸被更敏感的流式細胞儀檢測所取代[37]。例如，筆者在1987報道了52例細胞毒檢測陰性，但流式細胞儀法陽性的腎移植患者，其中33﹪的患者其移植物在術(shù)后1個月內(nèi)被排斥掉，而另外一組流式細胞儀檢測陰性的患者，1個月內(nèi)的移植失敗率為8﹪[38]。以后的類似研究顯示，148例流式細胞儀檢測陽性的腎移植患者，1個月內(nèi)的移植失敗率為20﹪[39]。此外，即便患者的抗體在移植前呈弱陽性反應(yīng)，對移植物的危害也是顯著的。目前，DSA的檢測意義已經(jīng)獲得了公認。通過檢測患者DSA而排除抗原相對應(yīng)的供者，再加上敏感的交叉配型試驗，移植前被致敏和沒有致敏的腎移植患者，其存活率相同，即便是再次移植，其存活率也與首次移植的存活率相同[40]。

通過非血清學方法確定移植物排斥抗體存在的早期方法是通過活檢檢測C4d。C4d染色陽性的患者，其存活率低于C4d陰性的患者[41]，許多研究證實了類似的結(jié)果。但最近的一些研究表明，許多抗體介導的排斥病例，C4d檢測結(jié)果為陰性[42]。盡管如此，C4d染色可證實抗體破壞腎臟毛細血管方面的作用。如果抗體導致移植失敗，人們應(yīng)該能夠從排斥的腎臟上洗脫下抗體，以證實抗體確實存在。試驗表明，從超級排斥的腎臟上可通過洗脫技術(shù)獲得HLA抗體[43]。同樣的結(jié)果也見于慢性排斥的腎臟。

體液免疫的新實驗證據(jù)仍在陸續(xù)報道。例如，同種系的小鼠心臟移植，如果將導致超免疫(hyperimmunized)的血清注入給小鼠，可導致心臟血管的損傷，由此證明抗體在體內(nèi)的作用[44]。另一項很有說服力的研究來自獼猴腎移植實驗。首先，針對供者的抗體被發(fā)現(xiàn)，然后出現(xiàn)C4d沉積，繼而發(fā)生腎小球損傷，最終導致移植失敗[45]。通過這些研究，人們不難發(fā)現(xiàn)抗體的首先出現(xiàn)引發(fā)了隨后的各種反應(yīng)及病理變化。

隨著抗體檢測敏感性的提高，大量極具說服力的研究結(jié)果進一步證實了抗體與排斥的緊密關(guān)系。例如，1969年的相關(guān)報道指出，54﹪腎移植排斥的患者血清中可檢測出抗體[33]。當抗體檢測包括了HLA-DR位點后，72﹪的腎移植排斥患者被檢測出抗體。隨著檢測技術(shù)的進一步提高，腎移植排斥患者的抗體陽性率達到了82﹪[46]。Harmer等[47]應(yīng)用流式細胞儀檢測法，發(fā)現(xiàn)95﹪的排斥患者存在抗體。在抗體檢測的敏感性方面，抗人球蛋白增強型補體依賴細胞毒方法可達到與流式細胞儀法相同的敏感性。一項大標本量(826例排斥患者)的研究表明，96﹪的患者被檢測出抗體[48]?？贵w與排斥如此明確的強關(guān)聯(lián)，提示抗體是引發(fā)排斥的元兇。

對抗體作用的主要異議是：抗體可能是排斥的結(jié)果，而非誘因。澄清這一因果關(guān)系需要確定抗體是否在排斥前已經(jīng)存在，獲得這樣的證據(jù)存在難度。因需要對患者進行長期隨訪，并評估排斥前后的抗體狀況，幸運的是一些移植中心儲存了患者的血清，使回顧性研究抗體的作用成為可能。2004年，Lee等[49]首次報道了這方面的研究結(jié)果，他們的研究涉及到過去8年中29例均有血清檢測歷史記錄的排斥患者，結(jié)果表明，發(fā)生排斥的所有患者，排斥前均產(chǎn)生了抗體。隨后，英國的曼徹斯特實驗室也報道了類似的結(jié)果[50]。目前已證實，抗體出現(xiàn)在排斥發(fā)生之前，由此不難看出抗體與排斥的關(guān)系。筆者等人分別在2000和2003年發(fā)表了器官移植體液免疫理論的綜述，希望這一理論的提出能引起足夠的重視及爭論[51-52]。

三、單一抗原微珠法檢測

1987年，Bjorkman等[53]在鑒定HLA分子結(jié)構(gòu)方面作出了重大的突破。有了這樣的基礎(chǔ)，通過重組細胞株可獲得單一抗原特異性，并由此促成了Luminex單一抗原微珠檢測技術(shù)的誕生。該技術(shù)是將單一HLA抗原包備在每個不同顏色的微珠上。進而精確地檢測出抗體的特異性[54]，包括DSA。

圖1顯示，患者在移植失敗前產(chǎn)生了針對供者的DQ2和B58抗體(DSA)，一段時間后血清肌苷升高，移植物被排斥[55]。Miller等[56]，Rebellato 等[57]，Kinukawa 等[58]，van den Berg-Loonen等[59]眾多專家隨后分別報道了類似的結(jié)果。這些研究滿足了確定因果關(guān)系的重要標準，即抗體先出現(xiàn)，然后發(fā)生移植排斥。Hill[60]針對吸煙與肺癌的相關(guān)性提出了9項確定因果關(guān)系的標準，這些標準也滿足HLA抗體導致移植排斥的因果關(guān)系[61]。

圖1 HLA抗體（DSA）在移植失敗前產(chǎn)生，然后發(fā)生血清肌酐升高，移植物被排斥

一項前瞻性研究表明，在術(shù)后移植物功能良好的患者中，有25﹪的患者發(fā)現(xiàn)有抗體[62]。一項眾多中心參與，涉及2231例患者的國際合作研究表明，對移植物功能良好的患者進行1次抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體的陽性率也為25﹪，移植后4年，具有抗體的患者，其存活率明顯低于沒有抗體的患者[63]。同樣的現(xiàn)象也見于抗MICA抗體(圖2)。需要強調(diào)的是，所有這些患者只檢測1次抗體。然后根據(jù)當時是否存在抗體分別總結(jié)存活率。筆者認為，針對這樣的結(jié)果，惟一可行的解釋是：抗體造成移植物存活率降低。這僅是第一次前瞻性研究獲得的證據(jù)。心臟移植和肺移植同樣顯示抗體導致存活率降低[64]，可以作出結(jié)論，在評估移植物存活后果方面，HLA抗體比任何其它因素都具有預(yù)測性。

圖2 HLA抗體與腎移植排斥的前瞻性研究。所有被檢測的患者，其移植物功能良好至少1年以上

長期以來，肝移植一直被認為不受抗體的影響，但肝移植患者首次經(jīng)歷了類似的研究。原因是位于克林特馬爾姆(Klintmalm)的一個移植中心儲存了過去20年1000例移植患者的血清[65]。在39例排斥患者中，95﹪在排斥發(fā)生前存在抗體，而同期移植的對照組患者中，只有41﹪的患者存在抗體。由此提示，肝移植并非可以免除抗體造成的損傷，因移植后抗體確實存在。類似的情況也見于心臟移植。例如，Rose的一個心臟移植中心也儲存了過去15年的血清，對比顯示，產(chǎn)生抗體的患者，其移植存活率低于沒有產(chǎn)生抗體的患者[66]。在胰島細胞移植方面，移植物失敗與抗體形成相關(guān)[67]，圖3顯示，患者C肽水平降低，而DSA水平對應(yīng)性增高。筆者認為，體液免疫理論適用于所有的同種異體移植，包括腎臟、心臟、肝臟、肺臟和胰島等移植。

圖3 移植后，供者特異性抗體A2升高，C肽對應(yīng)性降低

另一個重要的問題是HLA相合是否可以影響移植物存活率。Mickey等[68]在1971年報道了HLA配型對腎移植的影響。之后的40年爭論不斷，很多HLA相合很差的患者，其存活率卻很理想。最近，聯(lián)邦器官管理機構(gòu)(UNOS)停止了反映HLA錯配的記分要求，理由是該記分系統(tǒng)的益處不是很明顯。新的觀念是任何錯配都可考慮移植，重要的是移植后需要監(jiān)測抗體的生成，因為產(chǎn)生抗體可導致移植失??；而不產(chǎn)生抗體常預(yù)示移植物功能良好。當然，錯配應(yīng)該避免，因其與抗體形成相關(guān)，尤其是錯配使得二次移植更為困難。然而，對于心臟、肝臟和肺臟等移植，醫(yī)生常常沒有其它選擇而必須移植錯配的器官。筆者曾倡導建立腎臟的器官運輸系統(tǒng)，以使更多的患者獲得零錯配的移植，截止到目前，在美國已經(jīng)有2萬名以上的腎移植患者通過該系統(tǒng)獲得零錯配的移植，幸運的是，目前UNOS的供者選擇政策仍保留了器官運輸系統(tǒng)功能。

堅持控制錯配的政策可以使剛剛進入等待器官名單中的部分患者因獲得了更好的相合器官很快獲得移植，而因為沒有相合程度好的器官，許多患者常常需要等待10年以上，這似乎不大公平，尤其是完全相合的移植，其10年存活率的優(yōu)勢僅為2﹪～5﹪。大量累積的證據(jù)提示，如果抗體造成慢性排斥，去除抗體可防止排斥的發(fā)生。一項重要的研究顯示，硼替佐米(Bortezomib，一種漿細胞蛋白酶抑制劑)具有清除抗體的功能。圖4顯示，抗體降低50﹪以上的患者，其5年存活率為100﹪，而抗體沒有被清除的患者，大部分患者在移植后5年期間內(nèi)，移植物丟失[69]。

調(diào)整免疫抑制劑用量加上清除抗體可改善腎移植存活率。例如，在增加驍悉用藥劑量的患者中，抗體被清除的患者，其存活率可達100﹪，而沒有清除抗體的患者存活率受到影響[70]。法國的一家移植中心通過血漿置換和靜脈注射IgG也獲得了類似的結(jié)果[71]。治療后抗體被清除的患者，其存活率會明顯高于那些治療后抗體仍存在的患者的存活率，例如，肺移植患者中，清除DSA可獲得較高的存活率[72]。

四、結(jié)論

大量的研究結(jié)果證實了體液免疫理論，尤其是不同的實體器官移植均存在抗體相關(guān)排斥，最為明顯的是，DSA出現(xiàn)在排斥發(fā)生前，說明抗體是器官移植排斥的原因。前瞻性的研究也顯示，即便只檢測1次，抗體陽性的患者，其4年存活率明顯低于抗體陰性的患者。目前，臨床醫(yī)生正在應(yīng)用抗體檢測技術(shù)監(jiān)測移植后的抗體產(chǎn)生情況及設(shè)法清除抗體，這些措施無疑會改善移植患者的長期存活質(zhì)量。

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