史長生

（天津市南開區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測所，天津 300100）

食品中大腸菌群測定的分析研究

史長生

（天津市南開區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測所，天津 300100）

大腸菌群的檢測作為食品檢驗(yàn)中的重要微生物學(xué)指標(biāo),已是常規(guī)監(jiān)測中必不可少的一個(gè)項(xiàng)目和判斷食品安全的一個(gè)重要指標(biāo)。國家先后制定了一系列的大腸菌群檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過了多次修改。本文通過對新、老國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，測定的注意事項(xiàng)，以及對大腸菌群超標(biāo)原因等進(jìn)行分析研究，以使食品生產(chǎn)企業(yè)和經(jīng)銷商對可能受污染的各項(xiàng)環(huán)節(jié)加強(qiáng)管理，嚴(yán)格清除污染源，切實(shí)保證食品大腸菌群的達(dá)標(biāo)，從而保障食品安全。

大腸菌群；新老國標(biāo)；檢測方法；分析研究

隨著食品生產(chǎn)和消費(fèi)的旺季來臨，也是食品安全問題容易發(fā)生的敏感時(shí)期，在近期我市對食品生產(chǎn)加工和餐飲市場進(jìn)行的全面檢查中，我們發(fā)現(xiàn)其中不合格食品的質(zhì)量問題相當(dāng)一部分集中于大腸菌群超標(biāo)。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一種細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括了埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬[1]，大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。大腸菌群作為食品在微生物學(xué)上是否安全的指標(biāo)，反映了食品被人或動物腸道菌污染的可能性，如大腸菌群嚴(yán)重超標(biāo)預(yù)示著存在腸道傳染病或食物中毒的潛在危險(xiǎn)。消費(fèi)者食用大腸菌群超標(biāo)的食品，能夠惹起急性中毒、嘔吐、腹瀉等癥狀。例如，2011年5月因食用蔬菜引起的受腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染引發(fā)的溶血性尿毒綜合征在歐洲多國陸續(xù)暴發(fā)，疫情從德國蔓延至瑞典、丹麥、英國和奧地利等國導(dǎo)致多人死亡；2010年7月，美國“新鮮快遞”公司曾召回一批遭污染的蔬菜制品，被查含有O157：H7型大腸桿菌；2006年10月，美國發(fā)生“毒菠菜”事件曾蔓延至20多個(gè)州，導(dǎo)致204人患病，其中3人死亡，病源極有可能是野豬將大腸桿菌帶到了菠菜田里。所以說，大腸菌群的檢測作為食品檢驗(yàn)中的重要衛(wèi)生學(xué)指標(biāo),已是常規(guī)監(jiān)測中必不可少的一個(gè)項(xiàng)目和判斷食品安全的一個(gè)重要指標(biāo)。

1 大腸菌群檢測標(biāo)準(zhǔn)的演變

目前我國現(xiàn)行的食品大腸菌群檢測標(biāo)準(zhǔn)主要有國家標(biāo)準(zhǔn)“GB 4789.3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)”和出入境檢驗(yàn)檢疫局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“SN/T 0169-2010進(jìn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法”。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在這里我們不多做介紹，重點(diǎn)了解一下國家標(biāo)準(zhǔn)的變更。

近幾年，食品安全問題越來越被政府和老百姓所重視，而大腸菌群是作為食品安全一個(gè)很重要的微生物指標(biāo)，檢測食品中大腸菌群數(shù)是判斷樣品是否被人、畜糞便污染及污染程度的標(biāo)志，可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，以及潛伏著食物中毒和流行病的威脅，是否對人體健康具有潛在的危險(xiǎn)。所以從食品安全要求來看，食品中檢測出的大腸菌群要求控制在一定范圍內(nèi)，為此國家先后制定了一系列的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過了多次修改。前幾年我國由于食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)未完全統(tǒng)一，造成國內(nèi)在較長時(shí)間內(nèi)對食品中大腸菌群檢測的方法新舊國標(biāo)并存的情況。當(dāng)時(shí)食品檢測中我國大部分還是沿用老國標(biāo)2003版的形式，造成在2008版的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后不久，衛(wèi)生部就發(fā)出了2009年第16號文，明確了指標(biāo)以MPN/100 mL（g）為單位的，仍然按照2003版國標(biāo)進(jìn)行測定。直到食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)2010版出臺，并從2010年6月1號起開始實(shí)施，代替了歷次版本，但食品企業(yè)及第三方檢測機(jī)構(gòu)現(xiàn)今仍然有相當(dāng)一部分按照2003版老國標(biāo)對以MPN/100 mL（g）為指標(biāo)單位的樣品進(jìn)行檢測，如此便造成了國內(nèi)這幾年存在著新的國標(biāo)已發(fā)布舊國標(biāo)仍然執(zhí)行的共存局面。新版國標(biāo)是與國際接軌的檢測技術(shù)，大腸菌群的測定無論從原理方法、試劑材料等方面都做了較大的改動，結(jié)果的表示方式也與2003版國標(biāo)大相徑庭。

2 大腸菌群檢測方法簡要分析

大腸菌群的檢測一般就是按照它的定義進(jìn)行。雖然我國現(xiàn)行的是2010版國標(biāo)，但仍有很多實(shí)驗(yàn)室是在使用2003版國標(biāo)，所以有必要對新、老國標(biāo)進(jìn)行比較分析。

首先簡單介紹一下新、老國標(biāo)（GB 4789.3-2010與GB/T 4789.3-2003）的差異：第一，新、老國標(biāo)對大腸菌群的定義不盡相同。新國標(biāo)：大腸菌群是在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[2]。老國標(biāo)：大腸菌群是一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌[3]。第二，培養(yǎng)基完全不同，當(dāng)然制備方法也各異。老國標(biāo)：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。新國標(biāo)：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），煌綠膽鹽肉湯（BGLB）。第三，檢測方法及單位表示有所不同。新國標(biāo)：2種方法，一種LST-BGLB發(fā)酵MPN計(jì)數(shù)法，一種VRBA平板計(jì)數(shù)法，以每g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。老國標(biāo)：乳糖膽鹽發(fā)酵MPN法，以每100g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。

新、老國標(biāo)的定義雖然大同小異，但培養(yǎng)基制備、檢測時(shí)間、單位及檢測方法有所不同，就檢測方法來說，老國標(biāo)是三步法，即乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)，而新國標(biāo)是二步法，初發(fā)酵試驗(yàn)、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。從檢測時(shí)間上來看差不太多，新國標(biāo)要簡單些，減少了中間的染色鏡檢環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)儀器藥品、樣品制備及操作程序詳細(xì)見新、老國標(biāo)，這就不多做介紹了。新版國標(biāo)有兩種檢測方法，第一種方法LST-BGLB發(fā)酵MPN計(jì)數(shù)法適合樣品量少的時(shí)候，第二種方法VRBA平板計(jì)數(shù)法適用樣品量多的時(shí)候，結(jié)果準(zhǔn)確度沒有太大差異。從判定要求來看，老國標(biāo)只要顏色變了一般來說就可以判定是陽性管，哪怕沒有看到氣泡。但新國標(biāo)它只看產(chǎn)氣，沒有顏色上的變化要求。因此觀察發(fā)酵導(dǎo)管里的氣泡就很關(guān)鍵，如果觀察不仔細(xì)，有氣泡產(chǎn)生而沒發(fā)現(xiàn)，那么陽性管數(shù)就會減少，查的MPN值就會小，可能有問題的食品就沒查出來，反之沒問題的食品會被誤認(rèn)為有問題。發(fā)酵管里氣泡的產(chǎn)生、多少與菌的多少有很大的關(guān)系，菌多氣泡就多，也容易觀察，但氣泡少的時(shí)候就很難觀察了。為了準(zhǔn)確觀察到導(dǎo)管里產(chǎn)生的氣泡，必須保證殺菌完后導(dǎo)管里沒有氣泡[4]。

再來說一下什么是MPN法。MPN為最大可能數(shù)（Most Probable Number）的簡稱。這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給出3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度3只試管，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。特別注意的是，新、老國標(biāo)所附MPN檢索表所用稀釋度是不同的，所以結(jié)果報(bào)告單位表示也不相同。雖然對大腸菌群結(jié)果的表述完全不同了，老標(biāo)準(zhǔn)是 100 mL（g）的含量，而新標(biāo)準(zhǔn)是 1 mL（g）的含量，但不能單純把新標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)大100倍，新標(biāo)準(zhǔn)更能說明產(chǎn)品的污染程度，準(zhǔn)確性更高。

我們可以借助相關(guān)研究的結(jié)果，對新、老國標(biāo)檢測方法有更直觀的認(rèn)識和理解。見表1。

表1 乳糖膽鹽發(fā)酵法和LST-BGLB發(fā)酵法實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比表Table 1 Bile salt lactose fermentation method and LST-BGLB fermentation experiment table

表1為用乳糖膽鹽發(fā)酵法和LST-BGLB發(fā)酵法進(jìn)行檢測的結(jié)果。乳糖法查表單位為MPN/100 g，LST法查表單位為MPN/g，為使兩方法具有可比性，將LST法查表結(jié)果×100。對不同樣品分別用兩種方法進(jìn)行檢測，進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明兩方法結(jié)果雖不存在明顯差異，但兩個(gè)結(jié)果并不完全一致。從數(shù)據(jù)分析可知，兩結(jié)果并沒有明顯差異，但在實(shí)驗(yàn)的大多數(shù)情況上，二者相差一到兩管陽性管，并且可以看出，LST法的靈敏度更高[5]。

大腸菌群測定的注意事項(xiàng)：第一，初發(fā)酵中的陽性管不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測過程中，證實(shí)試驗(yàn)或復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)是必需的。第二，在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，氣泡的判斷很重要，我們經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡，甚至遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，則應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。第三，VRBA平板計(jì)數(shù)法中挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。

3 大腸菌群超標(biāo)原因分析

因?yàn)槭称飞a(chǎn)環(huán)境、運(yùn)輸條件和銷售過程中存在的隱患很多，所以大腸菌群不易達(dá)標(biāo)。大腸菌群不合格的原因有很多，最直接的原因就是污染，包括設(shè)備人員消毒不合格、原材料污染、加工過程污染、存儲運(yùn)輸環(huán)節(jié)不滿足食品保存條件要求等等。因此要避免大腸菌群超標(biāo)最關(guān)鍵的就是保證從原材料到加工為成品、存儲運(yùn)輸全過程必須潔凈衛(wèi)生。另外還要注意的是，從銷售環(huán)節(jié)來看，即使食品運(yùn)到市場時(shí)是合格的，但在市場（例如超市）進(jìn)行小包裝分裝時(shí)，加工工人現(xiàn)場操作是不是規(guī)范，包裝盒、塑料薄膜等環(huán)節(jié)能否保證沒有二次污染。這都是問題！因此食品生產(chǎn)加工企業(yè)要對產(chǎn)品的生產(chǎn)加工、存儲運(yùn)輸以及經(jīng)銷商對銷售環(huán)節(jié)的二次包裝過程，均要對可能受污染的各項(xiàng)環(huán)節(jié)加強(qiáng)管理，嚴(yán)格清除傳染源，以保證食品大腸菌群的達(dá)標(biāo)，保障食品安全。

[1]李志明.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3-2010,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部、中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.3-2003,食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測定[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003

[4]李勤.新老國標(biāo)茵落總數(shù)大腸茵群測定實(shí)驗(yàn)的對比探討[J].食品與發(fā)酵科技,2010(6):69-71

[5]梁智安.食品中大腸菌群檢測的新舊國標(biāo)方法差異探討[J].廣西輕工業(yè),2011(6):21-22

Determination of Coliform Bacteria in Food Analysis and Research

SHI Chang-sheng
（The Tianjin Nankai Area Product Quality surveillance Examines Institute,Tianjin 300100,China）

Detection of coliform bacteria in food inspection of Microbiology indicators,is the routine monitoring of an essential items and determine food safety is an important indicator.The state has made a series of coliforms testing method and standard,and after a number of modifications.This article through to the new,the old national standard detection methods,determination of the notes,as well as on coliform exceed the standard reasons were analyzed,in order to make the food production enterprises and distributors for possible contamination of the link to strengthen management,strict cleaning pollution source,and ensure food coliform standard,thus ensuring food safety.

coliforms;new and old GB;detection method;analysis and research

史長生（1973—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品質(zhì)量安全分析，食品檢測。

2012-02-20