唐偉偉，王俊平，王碩

（教育部食品與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津科技大學(xué)，天津 300457）

2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的合成、表征及其應(yīng)用

唐偉偉，王俊平，王碩*

（教育部食品與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津科技大學(xué)，天津 300457）

以甲巰咪唑和溴乙酸為原料，合成了2-S-羧甲基-1-甲基咪唑，并對(duì)其進(jìn)行MS和1H NMR驗(yàn)證，然后以此化合物作為半抗原來合成甲巰咪唑酶標(biāo)記抗原，然后利用分子印跡技術(shù)在酶標(biāo)板上直接聚合制備仿生抗體，最后利用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定豬肉樣品中甲巰咪唑的殘留。2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的產(chǎn)率為73.8%～95%，IC50和IC15分別為（100±4）μg/L和（1.1±0.04）μg/L豬肉樣品中的甲巰咪唑回收率為77%～89%。且測(cè)定結(jié)果與HPLC方法具有良好的一致性。

甲巰咪唑；溴乙酸；表征；酶標(biāo)抗原；仿生酶聯(lián)免疫

甲巰咪唑有增進(jìn)蛋白質(zhì)代謝、提高瘦肉率的作用，因此會(huì)被不法者添加到動(dòng)物飼料中，動(dòng)物經(jīng)此類飼料飼喂后在尿液、肌肉及組織中會(huì)有不同程度的殘留。人在食用了殘留有甲巰咪唑的動(dòng)物性食品后會(huì)造成甲巰咪唑在人體內(nèi)的蓄積，從而產(chǎn)生蓄積毒性作用如膜性腎病、急性造血功能停滯[1]。

現(xiàn)在檢測(cè)甲巰咪唑的方法有薄層色譜法（TLC）[2]，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3-4]，高效液相色譜法（HPLC-UV）[5-7]，質(zhì)譜法（MS）[8]、毛細(xì)管電泳法（CE）[9-10]和分子印跡法[11]。但是還鮮見利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來檢測(cè)動(dòng)物源性食品中殘留的甲巰咪唑的報(bào)道。利用酶聯(lián)免疫吸附法最重要的一點(diǎn)就是半抗原的合成，然后進(jìn)一步合成酶標(biāo)抗原和免疫原。然而合成甲巰咪唑半抗原的報(bào)道并沒有見到。眾所周知，半抗原與載體蛋白連接必須有3個(gè)基本條件：半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)上必須帶游離氨基或游離羧基或者二種基團(tuán)皆有，本文研究用活化酯法合成甲巰咪唑酶標(biāo)抗原所需要的半抗原的兩種合成方法。合成機(jī)理見圖1。

圖1 2-S羧甲基-1-甲基咪唑合成路線Fig.1 Reaction scheme for the synthesis of 2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

旋蒸儀：瑞典Buchi公司；SHB-IV型雙A循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；BL-610分析天平：美國(guó)Sartorius公司；AV-400核磁共振儀：布魯克公司；LCQ Advantage液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo公司。

溴乙酸：國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；甲巰咪唑：99.7%，北京燕京藥業(yè)有限公司；濃鹽酸：北京化工廠；氫化鈉：天津市北斗星精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；四氫呋喃：色譜純，德國(guó)Merck公司；甲醇：色譜純，天津康科德公司。

試驗(yàn)前先將四氫呋喃做脫水處理。

1.2 2-S羧甲基-1-甲基咪唑的制備

甲巰咪唑的分子結(jié)構(gòu)上具有一個(gè)-CH3和一個(gè)-SH，本試驗(yàn)擬用溴乙酸與甲巰咪唑的巰基反應(yīng)，接上一個(gè)游離羧基的臂，即合成出了2-S羧甲基-1-甲基咪唑。

1.2.1 方法一

稱取5 g NaOH溶于40 mL水中，然后加入6.85 g甲巰咪唑，磁力攪拌15 min。15 min后，加入9 g溴乙酸，回流2 h。

待回流裝置冷卻后，用濃鹽酸將回流后的液體酸化至pH=1，然后加入等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取三次，收集有機(jī)相40℃減壓旋蒸，最終得到紅色油狀物質(zhì)，TLC（乙酸乙酯:甲醇=5:2），Rf=0.7。柱層析收集后面的成分，再40℃減壓旋蒸，最終得到紅色固體。收率為73.8%。

1.2.2 方法二

用分析天平準(zhǔn)確稱取5.71 g甲巰咪唑，然后將其溶解于裝有20 mL重蒸四氫呋喃的圓底燒瓶中，再稱取1.875 g氫化鈉（NaH與甲巰咪唑的摩爾比為1:1.5），多次少量將NaH加入到甲巰咪唑的四氫呋喃溶液中，會(huì)發(fā)現(xiàn)有大量氣泡產(chǎn)生，并且產(chǎn)生很多的熱量，故此過程要在冰浴中進(jìn)行。

再稱取7.5 g溴乙酸溶解于2 mL重蒸四氫呋喃中，逐滴加入到上述圓底燒瓶中，最后加雙蒸水將上述固體溶解，用濃鹽酸調(diào)pH至1，加入等量的乙酸乙酯萃取，萃取3次。收集有機(jī)相，40℃減壓旋蒸，最終得到紅色的半抗原，收率為95%。

1.3 酶標(biāo)抗原的制備

取一個(gè)25 mL的圓底燒瓶,稱取0.102 g半抗原，溶解于2.76 mL DMF中，再稱取0.068 g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）加入圓底燒瓶中。然后再稱取0.248 g N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），用最少量的二甲基亞砜（DMF）將其溶解，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下，一滴一滴向圓底燒瓶中加入DCC溶液，最后在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下避光反應(yīng)過夜。

24 h后離心，除去反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物1，3-二環(huán)乙基脲（DCU），取上清液。

用分析天平準(zhǔn)確稱取10.0 mg辣根過氧化酶（HRP），溶于2 mL 50 mmol/L的 K2HPO4緩沖液（pH=9.3）中。用微量移液器量取適量的上清液，緩慢滴加到上述酶溶液中，直至蛋白溶液出現(xiàn)輕微混濁，每滴加一次輕搖1 min左右，此過程要在冰浴中進(jìn)行。將混合液放入4℃冷藏柜攪拌過夜，取出后在室溫下用PBS攪拌放置1 h～2 h。

1 h～2 h以后，先將透析袋用去離子水潤(rùn)洗，用透析夾夾住一頭兒，再將酶標(biāo)抗原溶液裝入透析袋中，用2 L磷酸鹽緩沖液PBS溶液透析，每天換3次透析液，連續(xù)透析3 d。3 d后將透析袋取出，準(zhǔn)確量取透析袋中酶標(biāo)抗原溶液的體積，再加入等體積的甘油，放于-20℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶標(biāo)抗原稀釋度的優(yōu)化

抗體是分子印跡聚合物膜，是以甲巰咪唑?yàn)槟０宸肿?，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，直接在96孔酶標(biāo)板上直接聚合，然后用甲醇:冰乙酸=3:1的洗脫液將模板分子甲巰咪唑超聲洗脫。

將連接好的酶標(biāo)抗原原液從1:500開始進(jìn)行3倍梯度稀釋，每孔加入100 μL酶標(biāo)稀釋液，室溫孵育1 h。1 h后棄去酶標(biāo)稀釋液，用PBST洗板5次。每孔再加入150 μL底物顯色液，顯色30 min。30 min后每孔加入50 μL終止液。每孔吸出150 μL顯色后的溶液立即在雙波長(zhǎng)方式（450 nm～650 nm）下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值讀數(shù)。選擇對(duì)應(yīng)的吸光度值在1.2～1.4之間的酶標(biāo)稀釋度就是后續(xù)直接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)所用的酶標(biāo)溶液稀釋倍數(shù)。

1.5 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法操作步驟

在直接聚合的酶標(biāo)板上，每孔先加入100 μL甲巰咪唑標(biāo)樣溶液或樣品提取液，然后立即加入100 μL酶標(biāo)抗原溶液，以不加甲巰咪唑標(biāo)樣的孔為對(duì)照孔，室溫孵育1 h，然后棄去上清液，用PBST洗液洗板5次。在每孔中加入150 μL底物顯色液，室溫下反應(yīng)30 min。每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。在雙波長(zhǎng)方式（450 nm～650 nm）下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。

1.6 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)品配制成1000 mg/L甲醇貯備液，將其用5%甲醇-PBS稀釋至60 mg/L，再依次10 倍稀釋至 6000，600，60，6和 0.6 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.5的方法得到一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。

按照下式計(jì)算不同濃度甲巰咪唑?qū)乖贵w結(jié)合反應(yīng)的抑制率值：

式中：IC%為甲巰咪唑?qū)乖贵w結(jié)合反應(yīng)的抑制率；A對(duì)照為450 nm吸光值與650 nm吸光值的差值；A樣品為甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)液或樣液的平均吸光度值；A空白為不加入酶標(biāo)及甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以抑制率為縱坐標(biāo)，甲巰咪唑濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次試驗(yàn)均應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 樣品的準(zhǔn)備、添加回收試驗(yàn)和液相驗(yàn)證

稱取5.00 g豬肉樣品于50 mL離心管中，50、100、150 μL甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 mg/L），黑暗放置15 min。然后加入25 mL乙腈和1 mL 4 mol/L碳酸鉀溶液（除去豬肉中的蛋白質(zhì)），漩渦振蕩2 min，在4℃下3500 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，殘?jiān)猛瑯臃椒ㄔ偬崛∫淮危喜⑸锨逡?。分液漏斗中加?0 mL乙腈飽和的正己烷，液液萃取2 min除去脂肪，靜置分層后除去正己烷相，重復(fù)萃取三次。乙腈相中加入50 mL飽和氯化鈉溶液，使其乳化現(xiàn)象減小，液液萃取2 min后分離乙腈相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，用2 mL乙腈洗滌無水硫酸鈉，合并濾液于雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸干。用1 mL 5%甲醇-PBS溶液復(fù)溶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

液相色譜條件為：色譜柱采用反相Thermo C18反相柱（4.6 mm×150 mm,USA）。紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；直接進(jìn)樣量：20 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃。采用色譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。流動(dòng)相為:甲醇/水（10:90，v/v）。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-S羧甲基-1甲基咪唑MS表征

2-S羧甲基-1甲基咪唑MS表征見圖2。

由于接到甲巰咪唑結(jié)構(gòu)上的是一個(gè)-CH2COOH，在負(fù)離子出峰，反應(yīng)之前甲巰咪唑分子量是114，反應(yīng)之后分子量是172，由圖2可以看出在負(fù)離子出現(xiàn)一個(gè)比較高的171峰，即為2-S羧甲基-1-甲基咪唑的分子量減去一個(gè)H，而342是2-S羧甲基-1-甲基咪唑的分子量減去一個(gè)H的二倍體，從圖2可以看出合成出的成品是純度比較高的。

圖2 2-S羧甲基-1甲基咪唑的MS圖Fig.2 Mass Spectrogram of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

2.2 2-S羧甲基-1-甲基咪唑的1H NMR表征

2-S羧甲基-1-甲基咪唑的1H NMR表征見圖3。

圖3 2-S羧甲基-1甲基咪唑1H RNM表征Fig.3 1H NMR Spectrogram of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

氫譜以氘代乙腈為溶劑，在1H NMR圖中，δ4.626～4.641（δ為化學(xué)位移，代表譜峰位置）之間是咪唑環(huán)上兩個(gè)氫的共振峰。根據(jù)峰面積來看，δ4.134處是甲巰咪唑上的-CH3的共振峰。在甲巰咪唑巰基臂上后接的與-COOH相連的-CH2-在δ3.906處出現(xiàn)單峰，而在化學(xué)位移δ4.266是-COOH上氫質(zhì)子的共振峰。

2.3 酶標(biāo)稀釋度的優(yōu)化

對(duì)酶標(biāo)稀釋度優(yōu)化的結(jié)果見表1。

表1 不同濃度的酶標(biāo)的吸光度值Table 1 The OD of Methimazole-HRP in Different Concentration

由表1可以看出不同濃度的酶標(biāo)濃度有顏色梯度的變化，證明了辣根過氧化酶-HRP成功接到了甲巰咪唑半抗原上。酶標(biāo)最優(yōu)稀釋度為1:1500。

2.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 甲巰咪唑仿生酶聯(lián)免疫標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Methimazole BELISA standard curves

從圖4可以看出，以制備的分子印跡聚合物膜作為仿生抗體時(shí)，甲巰咪唑能與酶標(biāo)記甲巰咪唑競(jìng)爭(zhēng)吸附印跡膜的識(shí)別位點(diǎn)，產(chǎn)生明顯地競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，60 mg/L時(shí)抑制率可達(dá)到71%。在最適反應(yīng)條件下，建立的直接競(jìng)爭(zhēng)BELISA方法測(cè)定甲巰咪唑ELISA的靈敏度為100 μg/L，最低檢測(cè)限為 1.1 μg/L。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

為了驗(yàn)證所建立的BELISA方法在實(shí)際樣品測(cè)定中的應(yīng)用，50、100、150 μL 濃度為 1 mg/L 的甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加到5.00 g豬肉樣品中，然后采用直接競(jìng)爭(zhēng)BELISA方法檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA與液相色譜方法對(duì)豬肉樣品中添加回收甲巰咪唑的結(jié)果分析Table 2 Analysis Results of Spiked methimazole in pork samples by the developed BELISA and HPLC methods(Mean(S.D.,n=3)μg/kg

3 結(jié)論

從對(duì)合成出的產(chǎn)物的MS，1H NMR表征來看，證明了甲巰咪唑的-SH先與NaH或者NaOH發(fā)生反應(yīng)，然后在與BrCH2COOH發(fā)生反應(yīng)這一設(shè)計(jì)路線是可行的，但是利用NaOH合成出的產(chǎn)品需要進(jìn)行柱層析純化，而利用NaH合成出的產(chǎn)品純度很高，不需要后期的純化工作。合成出酶標(biāo)抗原以后，對(duì)酶標(biāo)稀釋度進(jìn)行了優(yōu)化，酶標(biāo)記抗原顯色有梯度的變化，表明酶標(biāo)記抗原連接成功。在仿生酶聯(lián)免疫分析方法的測(cè)定中，靈敏度和最低檢出限分別為（100±4）μg/L和（1.1±0.04）μg/L。在豬肉樣品中，甲巰咪唑的添加回收率為77%～89%，且測(cè)定結(jié)果與HPLC具有良好的一致性。

對(duì)于甲巰咪唑在動(dòng)物性食品中的殘留量的檢測(cè)方法有很多，但是用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來檢測(cè)甲巰咪唑的殘留很少，本文采用的是以分子印跡技術(shù)在96-孔酶標(biāo)板上直接聚合制備出仿生抗體，然后采用直接競(jìng)爭(zhēng)方法來檢測(cè)。以上酶標(biāo)記抗原連接方法的合成也為用傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis，Application and Characterization of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

TANG Wei-wei,WANG Jun-ping,WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education of China,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Methimazole can promote the metabolism of protein,it had been applied illegally to animals'feed to obtain more lean meat.It has serious health implications to people.There was no report about using artificial antibody of ELISA to monitor methimazole.2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole was synthesized with methimazole and bromoacetic acid,it was used as hepten in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay method.The product was characterized by MS and1H NMR.And then the Ag-HRP was synthesized.The production of 2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole was 73.8%-95%.The IC50and the detection limit values under optimized experimental condition were(100±4)μg/L and(1.1±0.04)μg/L,respectively.Good recoveries have ranged from 77%-89%,respectively.It had a good agreement for methimazole in comparative analysis with that using HPLC.

methimazole;bromoacetic acid;characterization;Ag-HRP;BELISA

天津自然科學(xué)基金（09JCYBJC14300）

唐偉偉（1986—），女（回），在讀碩士研究生，主要研究方向：食品安全檢測(cè)。

*通信作者

2011-12-22