張曉強(qiáng) 張延平

1 解放軍第309醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京 100091）

總RNA的提取是分子生物學(xué)研究常用技術(shù)之一，獲得高質(zhì)量的RNA是研究基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)。由于小鼠耳蝸膜迷路取材不便，加上組織較小，以往實(shí)驗(yàn)每次都需要犧牲多只小鼠，才能夠提取足夠量的耳蝸RNA供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。但由于小鼠存在個(gè)體差異，多只小鼠耳蝸組織混合提取RNA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能造成一定的影響。為此，本研究采用從單只小鼠的兩只耳蝸膜迷路組織中提取足夠量的總RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 手術(shù)器械、動(dòng)物與試劑 Olympus體視顯微鏡1臺(tái)，游絲鑷4把，眼科剪1把，高壓蒸汽滅菌30 min，烘干備用。SPF級(jí)野生型BALB／c小鼠（購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）和GJB2基因條件敲 除 小 鼠 cCx26loxp／loxp － Pax2Cre／＋（cCx26ko）（由美國(guó)Emory大學(xué)林曦教授實(shí)驗(yàn)室提供）P10、P18各6只。總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)，QIAGEN）、PCR試劑盒（北京百泰克）、玻璃研磨棒（北京天根生化），其余試劑均為分析純。所有槍頭及EP管均經(jīng)去RNase處理。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 動(dòng)物經(jīng)2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，斷頭取單只小鼠耳蝸，迅速移至超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下小心將耳蝸前面骨質(zhì)去除，取耳蝸膜迷路組織，迅速放入已加入300 μlQIAzol裂解液的1.5ml EP管中，用玻璃研磨棒在EP管中旋轉(zhuǎn)研磨2～3min，待耳蝸組織完全研碎后，加入700μl裂解液，上下顛倒混勻，室溫放置5min，按照以下步驟依次操作：

每管加入200μl氯仿，震蕩15s，離心15min（4℃、12 000＊g）；將水相層吸入新的EP管中，加入600μl 70%乙醇，混勻，分兩次轉(zhuǎn)入帶收集管的RNease Mini離心柱中，室溫離心15s（后續(xù)步驟均為室溫、≥8 000＊g或10 000rpm）；加350μl RW1緩沖液，離心15s洗膜；將80μl DNase I混合液（10 μl DNase I貯存液＋70μl RDD緩沖液）加在離心柱膜上，20～30℃放置15min；加350μl RW1緩沖液離心15s洗膜；加入500μl RPE緩沖液，離心15s洗膜；加入500μl RPE緩沖液，離心2min洗膜；全速離心1min，徹底清除殘余的緩沖液；將離心柱放于新的1.5ml EP管中，加入30μl RNeasy－free水，離心1min洗脫RNA。取10μl備用，其余－80℃保存。

取3～4μl RNA溶液用于普通瓊脂糖電泳（0.5%NaOH 處理器具，1%濃度，10V／cm，30min）檢測(cè)提取的RNA的質(zhì)量和完整性。其余6～7μl用于測(cè)定其260、280nm的吸光度 ，并根據(jù)260／280的比值評(píng)估RNA的純度。

1.2.2 RT－PCR反應(yīng)檢測(cè)RNA的質(zhì)量 取400 ng（不超過(guò)8μl，本實(shí)驗(yàn)提取后RNA濃度約50ng／μl，總量約50ng／μl×30μl＝1 500ng）提取的P10WT小鼠耳蝸組織RNA溶液，逆轉(zhuǎn)錄后cDNA作為模板 ，然后用GAPDH（小鼠來(lái)源，349bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄時(shí)采用RT2First Strand Kit試劑盒（Qiagen，美國(guó)），PCR反應(yīng)步驟參考陳茂華［1］的體系做適當(dāng)調(diào)整 ，1%瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物 ，溴化乙錠染色 ，觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RNA純度的檢測(cè) 通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)所提取的P10WT與P10Ko的總RNA，測(cè)得RNA紫外光吸收值（260／280）均在1.9到2.1之間（表1），說(shuō)明提取的RNA純度較高。另取3～4μl RNA溶液 ，用普通凝膠電泳檢測(cè) ，300V電壓下電泳30min，通過(guò)溴化乙錠染色，電泳結(jié)果顯示28S和18S的條帶清晰度較高，表明RNA完整性較好（圖1）。

表1 單只小鼠耳蝸膜迷路組織RNA提取純度及濃度

2.2 RT－PCR反應(yīng)檢測(cè)RNA的質(zhì)量 用所提取的總RNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT－PCR反應(yīng)，得到相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，GAPDH擴(kuò)增出的目的基因片斷單一，亮度較高（圖2），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)提取的RNA的質(zhì)量完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的需要；而且提取的RNA的純度較高，說(shuō)明可用于以后的cDNA文庫(kù)的建立。

圖1 P10WT和P10Ko的RNA電泳結(jié)果

圖2 為2個(gè)P10WT反轉(zhuǎn)錄后cDNA用GAPDH進(jìn)行PCR的產(chǎn)物電泳結(jié)果（M為 Marker，1、2均為P10WT反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，GAPDH條帶大小為349bp）

3 討論

小鼠耳蝸深藏在骨性迷路中，膜性組織量較少，取材具有一定的難度，用于提取RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)不僅需要保證在耳蝸離體后最短時(shí)間內(nèi)取出膜迷路，還需要有一個(gè)特異性的組織徹底破碎方法，再結(jié)合有效的RNA提取步驟，方可保證在組織量較少的組織中獲得足夠量的RNA。因此組織破碎步驟對(duì)于后續(xù)的RNA提取步驟至關(guān)重要。通常，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織RNA抽提時(shí)使用的組織破碎方式主要是液氮研磨，可使組織快速破碎，同時(shí)低溫狀態(tài)有效抑制了RNA酶活性，減少了RNA的降解。但對(duì)于體積較小的組織，液氮研磨損失較多，常常需要犧牲較多的動(dòng)物來(lái)彌補(bǔ)。為此，許多學(xué)者探索了小體積組織的研磨方式，鄧順等［2］改良了常規(guī)方法 ，用預(yù)先燒好的封頂槍頭將小型昆蟲(chóng)在裂解液中搗碎，再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，可以得到純度較高的RNA。但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中體會(huì)到槍頭搗碎方法無(wú)法將耳蝸膜迷路組織徹底破碎，使最終獲得的RNA量降低。小鼠耳蝸組織樣本量小，用其他研磨方法很容易導(dǎo)致收集不完全，而使用QIAGEN公司生產(chǎn)的電動(dòng)研磨器tissue ruptor則需購(gòu)買(mǎi)儀器，增加實(shí)驗(yàn)成本。因此，本實(shí)驗(yàn)中采用與EP管底部體積、形狀均相似的玻璃研磨棒進(jìn)行組織破碎，不僅不需要二次轉(zhuǎn)移研磨組織，而且還可在裂解液中破碎組織，有效避免了組織的浪費(fèi)和RNA的降解。根據(jù)我們所進(jìn)行的多次實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)驗(yàn)方法2～3分鐘即可將組織研磨完全，可有效防止RNA的降解，結(jié)合高質(zhì)量的少量組織提取試劑盒，可以從一只小鼠的耳蝸膜迷路組織中提取約1μg的總RNA，而且獲得的RNA純度較高，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異，使得小體積組織RNA的提取效率大大增加，同時(shí)可以節(jié)省很多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，縮短實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及準(zhǔn)備時(shí)間，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。本實(shí)驗(yàn)還縮短了實(shí)驗(yàn)周期，是一種高效、簡(jiǎn)便的小體積組織RNA提取方法，適用于不具備研磨儀器的實(shí)驗(yàn)者。

1 陳茂華，韓召軍.禾谷縊管蚜、麥長(zhǎng)管蚜乙酰膽堿酯酶基因片段的克隆與序列分析［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29：35.

2 鄧順，張友軍，褚東.一種提取小型昆蟲(chóng)的RNA提取的有效方法［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，2007，44：593.