王方園 吳瑋 王鴻南 韓浩倫 劉剛 李保衛(wèi)屈昌北 孟令照 薄少軍 丁瑞英 孫建芝

1 解放軍第306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京 100101）；2 中國航天員科研訓(xùn)練中心

風(fēng)洞是研究氣體流動及其與模型的相互作用，以了解實際飛行器或其他物體的空氣動力學(xué)特性的一種空氣動力實驗方法，目前廣泛應(yīng)用于我國航天事業(yè)的研究中。風(fēng)洞試驗過程中存在各種有害因素，如噪聲、密閉環(huán)境、有害氣體等，其中噪聲是最常見的危害因素之一。風(fēng)洞噪聲的特點是既有高頻噪聲又有低頻噪聲，既有脈沖噪聲又有持續(xù)噪聲，其作業(yè)場所的噪聲強度在一定試驗條件下均可超過國家標(biāo)準(zhǔn)允許的水平。目前關(guān)于噪聲性聾的研究已取得一定的進(jìn)展，但尚沒有進(jìn)一步關(guān)于風(fēng)洞噪聲危害的研究。為此，本研究對模擬風(fēng)洞噪聲環(huán)境下豚鼠聽功能及其內(nèi)耳毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物Caspase－3表達(dá)的變化進(jìn)行了觀察，以了解模擬風(fēng)洞噪聲對豚鼠聽功能及內(nèi)耳細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康白色紅目豚鼠30只（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重300～350g，耳廓反應(yīng)靈敏，鼓膜標(biāo)志清晰，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。實驗動物隨機分為2組：對照組6只（12耳）常規(guī)飼養(yǎng)；實驗組24只（48耳），因在ABR閾值測試麻醉過程中意外死亡6只，故余下18只（36耳）分為實驗組一、實驗組二、實驗組三，每組6只（12耳），分別于噪聲暴露3天（Explore 3，E3）、7天（Explore 7，E7）及噪聲暴露后7天（Recovery 7，R7）處死取材。

1.2 噪聲暴露方法 實驗組18只豚鼠分別放置于方形網(wǎng)狀不銹鋼籠內(nèi)，緊密排列在中國航天員訓(xùn)練中心聲學(xué)實驗室隔聲室中，給予模擬風(fēng)洞噪聲。模擬噪聲系統(tǒng)由數(shù)字音頻信號處理器產(chǎn)生模擬風(fēng)洞噪聲信號，經(jīng)功率放大器傳到揚聲器，揚聲器放置于豚鼠籠周圍。噪聲強度用BK2250手持式分析儀測量，為98.0±2dB（A），測試聲場豚鼠籠四角及中心各點聲強未見明顯差異，每日豚鼠處于模擬噪聲環(huán)境中8小時，每小時持續(xù)暴露30分鐘，間斷30分鐘。實驗組一6只（12耳）動物連續(xù)噪聲暴露3天；實驗組二6只（12耳）動物連續(xù)噪聲暴露7天；實驗組三6只（12耳）動物連續(xù)噪聲暴露7天，暴露后常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境下恢復(fù)7天。

1.3 聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測 實驗前所有動物進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)（ABR）測試，再分別于噪聲暴露1天（E1）、3天（E3）對實驗組18只（36耳）豚鼠進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)測試，噪聲暴露3天檢測結(jié)束后即刻處死實驗組一6只動物，取12只聽泡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。于噪聲暴露7天（E7）對實驗組二、實驗組三各6只動物（共24耳）進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)檢測，檢測結(jié)束后即刻處死實驗組二6只動物，取12只聽泡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。于噪聲暴露后3天（R3）、7天（R7）對實驗組三6只動物（12耳）進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)檢測，暴露后7天（R7）檢測結(jié)束后即刻處死實驗組三6只動物，取12只聽泡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。ABR檢測時，所有豚鼠以1.5% 戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉后應(yīng)用聽性腦干反應(yīng)儀（MEDSEN丹麥）在聲電屏蔽的測聽室內(nèi)完成檢測，記錄電極置于外耳道口后上緣皮下，參考電極置于顱頂，接地電極置于鼻尖，刺激強度0～97dB nHL，步距5dB，交替極性濾波短聲，刺激速率21.1次／秒，疊加次數(shù)1 024次，濾波帶寬100～3 000Hz，以剛好能引出可重復(fù)波Ⅲ的最小刺激強度為反應(yīng)閾。

1.4 細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Caspase－3免疫組織化學(xué)染色觀察

對照組在噪聲暴露前、實驗組豚鼠分別于噪聲暴露3天（E3）、7天（E7）及暴露后7天（R7）時經(jīng)1.5%戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔麻醉，迅速打開胸腔，經(jīng)左心室主動脈插管，快速注入300ml生理鹽水沖洗后，4℃4%多聚甲醛500ml灌注固定，斷頭取出雙側(cè)顳骨，以4%多聚甲醛作耳蝸內(nèi)灌流固定24h。EDTA脫鈣1周，30%蔗糖脫水2天，OCT包埋30分鐘，沿蝸軸水平冰凍連續(xù)切片，片厚8μm。采用Caspase－3抗體（Sigma美國），參照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，Caspase－3的表達(dá)情況由2名以上病理醫(yī)師根據(jù)Caspace－3顯色的深淺雙盲判別。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，實驗組各時間點ABR反應(yīng)閾比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾（表1） 實驗前對照組（21.98±5.98dB SPL）和實驗組動物（22.50±5.98dB SPL）ABR反應(yīng)閾無明顯差異。實驗組模擬風(fēng)洞噪聲暴露后各時間點ABR反應(yīng)閾：噪聲暴露1、3、7天的ABR反應(yīng)閾較噪聲暴露前明顯增高（P＜0.01），且暴露時間越長增高越明顯。噪聲暴露后3天，ABR反應(yīng)閾較噪聲暴露7天有降低（P＜0.05），表明豚鼠聽功能有一定恢復(fù)，噪聲暴露后7天ABR閾值與實驗前及暴露后3天相比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明豚鼠噪聲暴露后7天聽功能較噪聲暴露后3天進(jìn)一步恢復(fù)，但與噪聲暴露前相比，聽功能未能完全恢復(fù)。

表1 各組豚鼠各時間點ABR閾值（dB SPL，±s）

表1 各組豚鼠各時間點ABR閾值（dB SPL，±s）

注：＊與實驗組實驗前比較，P＜0.01；△與噪聲暴露7天比較，P＜0.05；＃與噪聲暴露后3天比較，P＜0.01

組別 動物耳數(shù)（耳） ABR 閾值對照組12 21.98±5.98實驗組實驗前 36 22.50±5.98噪聲暴露1天 36 35.73±8.11＊噪聲暴露3天 36 43.91±6.32＊噪聲暴露7天 24 53.18±6.28＊噪聲暴露后3天 24 46.40±11.59△噪聲暴露后7天 12 35.38±11.63＃

2.2 Caspase－3免疫組化染色結(jié)果（圖1） 實驗組豚鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及毛細(xì)胞的凋亡標(biāo)志物Caspase－3表達(dá)較對照組明顯增高，且于噪聲暴露7天最高，暴露后7天豚鼠內(nèi)耳Caspase－3的表達(dá)較前明顯減少。

圖1 實驗組不同時間點及對照組內(nèi)耳Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase－3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×80）

3 討論

研究［1］表明噪聲最主要的危害是損害人類的聽覺系統(tǒng)，可造成永久性聽力損失，風(fēng)洞噪聲作為一種特殊的噪聲類型，亦可能對其內(nèi)作業(yè)人員的聽覺系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響。本試驗?zāi)M某風(fēng)洞試驗室作業(yè)人員聽力損傷最嚴(yán)重作業(yè)點的噪聲強度、性質(zhì)及持續(xù)時間、累計劑量等，觀察此噪聲對實驗動物聽功能的影響，結(jié)果顯示，實驗組豚鼠模擬風(fēng)洞噪聲暴露1、3、7天的ABR反應(yīng)閾較噪聲暴露前均明顯增高，并呈現(xiàn)隨著暴露時間的延長反應(yīng)閾逐漸增高的趨勢。噪聲暴露后3、7天豚鼠ABR反應(yīng)閾逐漸下降，但噪聲暴露后7天其反應(yīng)閾與噪聲暴露前相比仍有10 dB的升高，說明模擬風(fēng)洞噪聲損傷急性期可產(chǎn)生暫時性閾移，這部分聽力損失可在噪聲暴露停止后逐步恢復(fù)，而隨著噪聲暴露量逐漸累積，可在暫時性閾移的基礎(chǔ)上產(chǎn)生永久性閾移，后者則很難恢復(fù)。

噪聲性聽力損失與內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系。研究表明［2～4］，Caspase－3可能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其可通過細(xì)胞外途徑（或稱細(xì)胞表面死亡受體途徑）和細(xì)胞內(nèi)途徑（或稱線粒體引發(fā)途徑）導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞外途徑中，死亡信號的傳導(dǎo)依賴于死亡配體與受體的結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，隨后Caspase－8被激活，它通過裂解促凋亡蛋白Bid（proapoptosis protein Bid）使線粒體釋放細(xì)胞色素C，或直接作用于Caspase－3及其他下游的Caspase。在細(xì)胞內(nèi)途徑中，細(xì)胞內(nèi)的死亡信號，如DNA損傷、毒素和ATP耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease activating factor 1，Apaf－1）、dATP和Caspase－9酶原結(jié)合形成調(diào)亡復(fù)合體，Caspase－9被釋放并激活，接著下游的Caspase－3、7等被激活降解底物使細(xì)胞凋亡［5～7］。本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察模擬風(fēng)洞噪聲暴露對實驗動物內(nèi)耳Caspase－3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，噪聲暴露過程中，豚鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及毛細(xì)胞Caspase－3的表達(dá)明顯增高，且于噪聲暴露7天最高，噪聲暴露停止后豚鼠內(nèi)耳Caspase－3的表達(dá)逐漸降低，說明模擬風(fēng)洞噪聲環(huán)境可導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。在模擬風(fēng)洞噪聲急性損傷中，其凋亡程度與噪聲暴露的累積量相關(guān)，噪聲暴露后，細(xì)胞凋亡減少但短期內(nèi)并不能完全恢復(fù)正常。

目前，關(guān)于噪聲性聽力損傷的研究一直是大家關(guān)注和研究的重點之一，近兩年，關(guān)于風(fēng)洞噪聲環(huán)境的危害也有了一定進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模擬風(fēng)洞噪聲環(huán)境對實驗動物聽功能可造成損傷，但其損傷的具體進(jìn)程和機制如何，以及此類噪聲環(huán)境的安全噪聲暴露量，仍需要在以后的實驗中繼續(xù)探索。

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