楊志波，唐雪勇，向麗萍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長沙410005）

銀屑病是一種常見的、原因不明的、紅斑丘疹鱗屑性慢性炎癥性皮膚病。其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究表明銀屑病的發(fā)病與γ-干擾素（interferonγ,IFN-γ）有重要關(guān)系，在銀屑病患者血清及角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度明顯高于正常人[1]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）廣泛存在于動植物細(xì)胞內(nèi)的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，其主要作用是將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)[2]。MAPK在銀屑病發(fā)病中的作用目前尚不明確，故文中對IFN-γ誘導(dǎo)銀屑病皮損培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞中MAPK活性進(jìn)行研究，探討其在銀屑病發(fā)病中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 γ-32P-dATP購自北京亞輝生物公司,蛋白酪氨酸激酶抑制劑（genistein，GST）購自美國Sigma公司。IFN-γ、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）及其余試劑和P81膜購自上海生物工程公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng) 銀屑病組和正常人組中角質(zhì)形成細(xì)胞分別來源于我院皮膚科銀屑病患者病檢皮損及整形美容外科切取的正常皮膚組織。術(shù)中取下皮膚，無菌條件下剪碎，標(biāo)本在DispaseⅡ（2.4 U/mL）5℃過夜孵化。組織用 Dulbecco’s PBS（含青霉素 200 IU/mL，鏈霉素 200 μg/mL，兩性霉素 B 5 μg/mL，慶大霉素 0.1 μg/mL）沖洗，然后上皮從下層結(jié)締組織機(jī)械分離，上皮層置于0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA小心吸移產(chǎn)生細(xì)胞懸液。然后，用含10%胎牛血清的基質(zhì)中和胰蛋白酶，懸液離心5 min。小丸懸浮于基質(zhì)，接種到含飼養(yǎng)層（含有絲裂霉素處理的NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞）的T-25組織培養(yǎng)盒中。細(xì)胞在基質(zhì)中培養(yǎng)，基質(zhì)組成：3份Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM） 培養(yǎng)基，1份Ham’s F12基質(zhì)含10%胎牛血清?；|(zhì)用青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 μg/mL，兩性霉素2.5 μg/mL，表皮生長因子（EGF）10 ng/mL，氫化可的松400 ng/mL補(bǔ)充。每2～3 d更換1次，培養(yǎng)皿保持在37℃，含5%CO2潮濕環(huán)境中。當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到75%～80%的鋪滿數(shù)時，用0.5 mmol/L EDTA 37℃處理5 min除去飼養(yǎng)層。培養(yǎng)物在37℃暴露到胰蛋白酶-EDTA 1～2 min，粘連的角質(zhì)形成細(xì)胞在37℃胰蛋白酶-EDTA孵化4～5 min或直到顯微鏡觀察證實(shí)大多數(shù)細(xì)胞已分開。在胰蛋白酶失活下，用血細(xì)胞計數(shù)器確定角質(zhì)形成細(xì)胞計數(shù)，然后細(xì)胞接種于組織培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)采用均為3～5代角質(zhì)形成細(xì)胞。細(xì)胞因子（IFN－γ）和GST 的加入：于 3～5代銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞靜息24 h后加入100 ng/mL IFN-γ作用30 min，抑制劑組在靜息24 h加入10 μg/mL GST DMSO儲存液，另設(shè)DMSO對照組以排除有機(jī)溶劑的影響。

1.2.2 培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞中MAPK活性檢測MAPK粗酶的制備 從培養(yǎng)的銀屑病皮損或正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞各5份加入溶解緩沖液（50 mmol/L β-甘油磷酸、100 mmol/L釩酸鈉、2 mmol/L氯化鎂、1 mmol/L乙二醇四乙酸、1 mmol/L二硫蘇糖醇、1%曲拉通X-100、20 μmol/L亮抑蛋白酶肽、100 U/L抑蛋白酶肽、1 mmol/L苯甲基磺酸氟），電動勻漿，置4℃離心 1 h（100 000 r/min），取上清，用福林一酚法測蛋白濃度。采用濾紙法[3]測MAPK活性。反應(yīng)總體積為 40 μL[依次加入氯化鎂/GST 10 μL、底物髓磷脂堿性蛋白（MBP）10 μL、酶液 10 μL、γ-32P-dATP 10 μL]，對照組不加酶液，用等量三蒸水代替，每樣均設(shè)有對照，將反應(yīng)管置37℃水浴15 min,加10 μL 25%三氯乙酸終止反應(yīng)，每樣取50 μL至P81微孔膜上，1%磷酸425 mL洗4次，丙酮漂洗、干燥后，每管加閃爍液[0.25 g四-雙-二（四-甲基-五-苯基惡唑）、2 g二，五-苯基惡唑、500 mL甲苯]7 mL，用液閃計數(shù)儀測定MAPK催化γ-32P摻入底物MBP的量，MAPK的活性以pmol/（mgprotein·min）表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計計量資料比較采用t檢驗(yàn)，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

培養(yǎng)的銀屑病皮損與正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)相似。培養(yǎng)的銀屑病皮損和正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞中MAPK的活性測定結(jié)果：①銀屑病皮損培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞中MAPK的活性為（32.44±4.49）pmol/（mg protein·min），正常人為（14.65±2.19）pmol/（mg protein·min），兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-7.966，P＜0.01）；②正常人組和銀屑病組在IFN-γ刺激后與基礎(chǔ)時相比MAPK的活性均明顯增高，GST刺激后與基礎(chǔ)時相比MAPK的活性明顯下降，在DMSO刺激下MAPK活性兩者均無明顯變化；③在接受IFN-γ、GST及DMSO刺激后，正常人組和銀屑病組之間MAPK活性的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1、圖 1。

表 1 IFN-γ、GST、DMSO 刺激后培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞MAPK的活性

3 討論

MAPK是一組被不同的細(xì)胞外刺激 (如生長因子、細(xì)胞因子、激素、藥物及細(xì)胞應(yīng)激等)激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK通路與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，對腫瘤的生長增殖起至關(guān)重要的作用[3]。多數(shù)研究顯示，MAPK通路在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，活性明顯增強(qiáng)，在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮極其重要的作用[4～7]。有研究表明,銀屑病患者皮損中EGF、PDGF等細(xì)胞生長因子顯著高表達(dá)，高水平的生長因子可導(dǎo)致MAPK的激活，從而將這些細(xì)胞增殖信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，最終通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子引起細(xì)胞增殖的改變[8-9]。細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中MAPK雖然擔(dān)任非常重要的角色，也只構(gòu)成了這一復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的部分，而且表皮細(xì)胞同時暴露于多種不同的刺激中。因此銀屑病表皮細(xì)胞的增殖過速可能是由多種因素綜合作用的結(jié)果，但是銀屑病患者皮損中高水平的生長因子可使MAPK過度激活，從而產(chǎn)生表皮細(xì)胞過度增殖的效應(yīng)[10]，說明MAPK可能參與了銀屑病表皮細(xì)胞過度增殖的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，與正常人相比，銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中MAPK的活性明顯增高。在加入IFN-γ刺激后，銀屑病組及正常人組與基礎(chǔ)時相比MAPK的活性明顯增高，而在GST刺激時，兩組MAPK活性較基礎(chǔ)值明顯下降，DMSO刺激下MAPK活性較基礎(chǔ)值無明顯變化。說明IFN-γ誘導(dǎo)MAPK活性的作用方式，可能是通過蛋白酪氨酸激酶直接或間接

促進(jìn)其活性增加，從而在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖過程中起重要作用。

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